1、TNP470 对结肠癌 Lovo 细胞生长的抑制作用【关键词】 结肠肿瘤 关键词: TNP-470;Lovo 细胞;脱噬作用;结肠肿瘤 摘 要:目的 探讨 TNP-470 对体内外人结肠癌 Lovo 细胞生长的影响. 方法 采用 MTT 法检测 TNP-470 对体外培养的 Lovo 细胞的生长抑制作用.建立结肠癌皮下移植瘤模型，16 只裸鼠平均分为治疗组（TNP-47030mg kg-1 ）和对照组（相同体积的生理盐水） ，4wk 后处死裸鼠，测量肿瘤体积.肿瘤组织行病理学检查，采用 HE 染色和 TUNEL 原位末端标记术检测体内肿瘤细胞的凋亡情况. 结果 TNP-470 作用 72h，明
2、显抑制体外培养的Lovo 细胞的生长，IC50 为 55.8g L-1 .TNP-470 显著抑制了体内肿瘤的生长，治疗组肿瘤体积为（73140）mm3 ，对照组为（134538）mm 3 ， （P0.01）.治疗组 Lovo 细胞凋亡率为（21.42.1）%，对照组为（7.51.5）%， （P0.001）. 结论 TNP-470 能够抑制结肠癌Lovo 细胞的体内外生长，其机制可能与诱导细胞凋亡有关. Keywords:TNP-470;Lovo cells;apoptosis;colonic neo-plasms Abstract:AIM To study the effect of TNP
3、-470on the growth of human colon cancer cell line，Lovo cells，in vitro and in vivo.METHODS Growth inhibitory effect of TNP-470on Lovo cells was examined by an MTT assay.Human colon cancer xenografts was transplanted into16nude mice.TNP-470（30mg/kg）or the same volume of saline solution was administere
4、d on alternative day starting1days after tu-mor implantation.Mice were sacrificed after4weeks and tu-mors were processed for histological examination.In both the treatment and control groups，tumor volumes were counted and apoptoses of Lovo cells were measured using HE staining and TdT-mediated bioti
5、nyated-dUTP nick end labeling（TUNEL）method.RESULTS In vitro，TNP-470inhibited the growth of Lovo cells，with its IC50at55.8g L-1 .In vivo，tumor volumes （134538）mm3 vs（73140）mm3 ，P0.01） were significantly reduced in the TNP-470group compared with the control group.Apoptosis indexes（AI）of Lovo cells wer
6、e statistically different between the two groups （21.42.1）%vs（7.51.5）%，P0.001） .CONCLUSION TNP-470is a potent agent to inhibit tumor growth of colon cancer in vitro and in vivo and this inhibitory effect may be associated with apoptosis. 0 引言 血管生成抑制剂 TNP-470 通过抑制血管内皮细胞生长和迁移，进而抑制肿瘤新生血管形成.TNP-470 还能抑制
7、体外培养的多种肿瘤细胞的生长，但对于 TNP-470 抑制肿瘤细胞生长的机制，研究结果不尽相同.我们通过 MTT 法检测 TNP-470 对结肠癌 Lovo 细胞的生长抑制作用，采用裸鼠皮下移植瘤模型，观察 TNP-470 对移植瘤生长及 Lovo 细胞的凋亡的影响，探讨 TNP-470 抗瘤作用的机制. 1 材料和方法 1.1 材料 雌性 4wk 龄 BABL/c 裸鼠，体质量 1722g，第一军医大学动物实验中心提供.结肠癌 Lovo 细胞株由第一军医大学消化研究所传代保存.RPMI1640 培养基、胰蛋白酶、新生小牛血清等均购自杭州四季青生物技术有限公司，DAB 显色试剂盒购自武汉博士德
8、公司，原位末端标记（TUNEL）试剂盒购自基因公司.TNP-470 由日本大阪 Takeda 化学公司Hiroshi Fukui 博士惠赠. 1.2 方法 1.2.1 Lovo 细胞增殖抑制实验 采用 MTT 法检测 TNP-470 对 LOVO 细胞生长抑制率.将对数生长期的 Lovo 细胞置 96 孔培养板中培养，48h 后实验组加入不同浓度的 TNP-470（510-4 5105 g L-1 ） ，每个浓度设 6 个复孔，对照孔加入相同体积不含 TNP-470 的 RPMI1640 培养基，并设空白对照孔（无细胞，仅含 RPMI1640 培养基）.培养 72h 后，每孔加入 MTT（5g
9、 L-1 ）20L，37反应 4h，小心吸去孔内培养液，再加入 150L 二甲亚砜（DMSO） ，充分溶解后在 Bio-Rad550 型酶标仪 570nm下测吸光度（A）值.按下列公式计算细胞生长抑制率:生长抑制率（%）=（对照组平均 A-实验组平均 A）/（细胞对照组 A-空白对照组 A）100%. 1.2.2 皮下移植瘤抑制实验 收集培养 3d 的 Lovo 细胞，生理盐水制成悬液，用 1.0mL 微量注射器将 0.2mL 细胞悬液（5106 5107 ）注入 2 只裸鼠颈部皮下.注射前注射部位消毒，4d 后重复接种 1 次.当接种部位肿瘤长至 1520mm 时，无菌条件下取材.将肿瘤组织
10、剪成1.52.0mm 小块，置于生理盐水中备用.裸鼠以 20g L-1 氯胺酮0.20.3mL 麻醉成功后，乙醇消毒接种部位皮肤，将切好的肿瘤组织块置于 18 号套管针口，分批接种于裸鼠背部皮下.16 只裸鼠随机分成 2 组，两组裸鼠体质量差异无显著性.手术当天给药，TNP-47030mg kg-1 ，sc，qod，对照组给相同体积的生理盐水.接种 30d 后断颈处死裸鼠，测量肿瘤体积，计算抑瘤率.将肿瘤组织于 40g L-1 中性甲醛固定 24h，石蜡包埋，连续切片（4m） ，常规 HE 染色及 TUNEL 标记染色.抑瘤率（%）=（对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积）/对照组肿瘤体积100%.
11、 1.2.3 TUNEL 染色检测凋亡细胞 TUNEL 染色具体步骤如下:切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水至水化，滴加 20mg L-1 蛋白酶 K，室温消化15min，去离子水洗 5min2，30mL L-1 过氧化侵氢甲醇液中室温下封闭10min，0.05mol L-1 PBS 洗 5min2，向组织片滴加平衡缓冲液，室温下孵育 60min，滤纸吸取标本周围液体，迅速滴加 TdT 酶，置湿盒中37孵育 60min，室温下切片入终止缓冲液中振荡孵育 10min，0.05mol L-1 PBS 洗 2min3，滴加过氧化物酶，室温下湿盒中孵育30min，0.05mol L-1 PBS 洗 2mi
12、n4，DAB 显色 510min，甲基绿复染10min， 脱水、透明、封片.以 0.05mol L-1 PBS 替代 TdT 酶作为阴性对照. 结果判定:以细胞核阳性为标准，凋亡细胞呈棕黄色细颗粒状或弥散性，散在或簇状分布于肿瘤组织中，个别者核膜增厚，呈棕黄色染色.结合 HE 染色，选择无细胞坏死的 5 个视野或 HE 染色证实为坏死的细胞不计数，采用德国 Kontron IBAS2.5 型全自动图像分析系统对 TUNEL 染色阳性细胞进行计数，每个视野计数 1000 个以上细胞，以阳性细胞所占百分率作为凋亡指数（apoptosis index，AI） ，取 5 个视野 AI 均值进行统计学分
13、析. 统计学处理:所有数据采用均数标准差（x s）表示，均数间比较用 t 检验，采用 Spss10.0 统计软件分析. 2 结果 2.1 细胞形态及 MTT 检测 随着 TNP-470 浓度的增加，梭形 Lovo 细胞逐渐变小变园，间隙增宽，细胞内颗粒增多，折光度下降，培养 48h后未见细胞密度明显增加，大部分细胞仍贴壁生长，少部分漂浮于培养液中.从 Lovo 细胞生长抑制率曲线可以看出，TNP-470 的抑制作用存在量效倚赖关系，回归分析得出 72h 的 IC50 为 55.8g L-1 （Fig1）. 图 1 略 2.2 肿瘤体积 两组裸鼠皮下移植瘤在移植 12d 后生长明显，但TNP-4
14、70 组肿瘤在 20d 后生长几乎处于停滞状态，体积未见明显增加.最终对照组皮下瘤体积为（134538）mm3 ，TNP-470 组为（73140）mm3 ，两组肿瘤体积差异有显著意义（P0.01） ，抑瘤率达 45.6%（Fig2）. 2.3 TUNEL 染色结果 对照连续切片 HE 染色（Fig3A） ，镜下凋亡细胞 TUNEL 染色表现为细胞核呈棕黄色染色.阳性反应产物在凋亡细胞内呈不均匀分布，近核膜处着色较深，核中央着色较浅，核固缩则染色质呈块状集聚.有的细胞核固缩不明显，整个细胞呈浅棕黄色，可能是细胞处于凋亡早期，未凋亡细胞的胞核为蓝绿色（Fig3B）.治疗组肿瘤细胞凋亡率为（21.
15、42.1）%，对照组为（7.51.5）%，差异有显著意义（P0.001）. 图 2 略 3 讨论 目前研究表明，血管生成是恶性肿瘤迅速生长、转移、扩散的主要条件之一1 .恶性肿瘤生长转移的血管依赖性也提示:通过抑制肿瘤的血管生成可以有效的防治肿瘤的生长、浸润和转移2 .结直肠癌是消化道常见肿瘤，自 20 世纪 70 年代以来，结直肠癌发病率在我国逐渐上升3 .我们利用血管抑制剂 TNP-470 观察其对实验性结肠癌的治疗效应.实验表明，TNP-470 对体外培养的人结肠癌 Lovo 细胞的生长有较强抑制作用，抑制作用呈量效依赖关系. Yakmamoto 等4 观察到 TNP-470 可诱导 5
16、 种乳腺癌细胞（MDA-MB-231，T-47D，MCF-7，KPL-1，MKL-F）凋亡，并检测到促凋亡蛋白Bax，Bcl-xS 表达明显增加，凋亡抑制蛋白 Bcl-2，Bcl-xL 的表达显著下降.动物实验也表明，TNP-470 抑制肿瘤生长的同时，肿瘤细胞凋亡显著增加 5，6 .因此 TNP-470 的体内抗瘤效应是通过抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡双重作用实现的.我们采用 TUNEL 染色法检测肿瘤组织中Lovo 细胞的凋亡情况，镜下观察到 TNP-470 组有大量的肿瘤细胞核被染成棕黄色，凋亡细胞在肿瘤组织中弥散分布，而 HE 对照染色典型凋亡细胞较少，可能是部分细胞处于凋亡早期
17、.我们结果表明，TNP-470 对体内外结肠癌 Lovo 细胞的生长有较强的抑制作用，该作用可能与 TNP-470 诱导 Lovo 细胞凋亡有关.实验结果也提示:对于血管形成期的肿瘤，TNP-470 可通过抗血管生成作用抑制肿瘤的生长和转移. 图 3 略 参考文献: 1Liu DH，Zhang XY，Huang XY，Fan DM.Construction of eu-karyotic expression vector of VEGF165gene and its effect on oncogenesis of human gastric carcinoma J.Di-si Junyi D
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