1、 半乳糖苷结合凝集素9 真核表达载体的构建和鉴定作者：邱文洪 吴丽娜叶 许楚娟 易路阳 郭凯文【摘要】 目的： 构建 半乳糖苷结合凝集素9 的真核表达载体并鉴定。方法：通过 DNA 重组技术和 PCR 方法从人外周血单个核细胞克隆 半乳糖苷结合凝集素9 基因，插入真核表达载体 pcDNA3.1(+)中，通过 PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果：DNA 测序和酶切鉴定证明 半乳糖苷结合凝集素9 基因正确克隆至 pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论：成功构建 半乳糖苷结合凝集素9 的真核表达载体pGal9 。 【关键词】 Gal9; 构建; 真核表达载体半乳糖凝集素家族(galect
2、in family)成员参与了许多生理和病理过程，包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA 转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等1，2。 半乳糖苷结合凝集素9(Gal9) 是一种糖结合蛋白，属于半乳糖凝集素家族(galectin family)成员，组织分布广泛，在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面，发挥着重要作用3。目前对Gal9 发挥作用的具体机制仍知之甚少，值得进一步深入探讨和研究，从而使 Gal9 作为疾病治疗的新的靶点成为可能。为此，本研究拟通过构建表达人 Gal9 蛋白的真核表达载体，为进一步研究 Gal9 的作用机制打下基础。1
3、 材料和方法1.1 材料T4 连接酶、限制性内切酶(MBI)，Taq 酶和 RT 试剂盒(Promega)，RNA 提取试剂盒(Invitrogen)，质粒提取试剂盒、DNA 凝胶纯化试剂盒(Qiagen)，DNA marker(Tiangen)，Trizol、1640 培养基，人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Galectin9 引物(英骏生物技术有限公司)。1.2 引物设计参照 GenBank 上 Gal9(NM009587.2) 序列设计引物如下:上游引物:P1 5CCAAGCTTGGGTTAAGTCGTTCCCTCTACA
4、A 3 ，下游引物:P2 5CGGAATTCCGAGGACCCAGACTGCCCCAC 3 ，下划线分别为 Hind和EcoR酶切位点,扩增 Gal9 的 CDS 序列,共 1176 bp。1.3 分离人外周血单个核细胞静脉取血，加入肝素溶液(1050u/m1 血样本)抗凝，用 pH7.2 Hanks 液将抗凝血稀释 1 倍;吸取人淋巴细胞分离液置于刻度离心管中，加入稀释的全血; 2000 r/min 离心 20min;吸取所有单个核细胞，用Hanks 液洗涤细胞 3 次。将单个核细胞离心收集备用。1.4 单个核细胞总 RNA 的制备、RTPCR 及克隆入载体pcDNA3.1(+)将离心收集的
5、单个核细胞 1105 加入 Trizol 1 mL，混匀，室温5 min;加 0.2 mL 氯仿，涡旋 15 s， 412 000g，离心 10 min，吸取上清液至另一 1.5 mL Eppendorf 管，加入等体积预冷的异丙醇，放置 10 min，412 000g，离心 10 min，去上清液，加入 1 mL 预冷的浓度为750 mL/L 乙醇，充分混匀振荡，412 000g，离心 10min，去上清液，充分干燥，用 50L 含 1 mL/L DEPC 的 ddH2O 溶解沉淀，获得细胞总RNA。取 5L 总 RNA，按 RTPCR 试剂盒推荐方法以 oligo(dT)为引物合成 cDN
6、A 第一链。取 2l 逆转录产物为模板,加入 10 mM dNTP 1. 5 ml,10PCR 缓冲液 5m,l 50mMMgSO41m,l 两引物各 10pmo,l 补水至 50m,l PCR 反应条件为: 95预变性 5 min，94变性 15s，55退火30s，72延伸 1 min，反应 30 个循环后，72延伸 10 min。取 PCR 产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳分析。按照 Wizard PCR 产物纯化试剂盒说明书纯化，回收 PCR 产物，经 Hind和 EcoR双酶切，定向插入表达载体pcDNA3.1(+)的相应位点。该质粒命名为 pGal9 ，经 PCR、Hind和EcoR双酶
7、切及测序鉴定序列的正确性。1.5 统计学方法采用 Prism4.0 软件行单因素方差分析，以及组间比较。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 Gal9 的 RTPCR 扩增从单个核细胞中提取细胞总 RNA，以此为模板，应用前述引物进行RTPCR ，将扩增产物于 10 g/L 琼脂糖电泳中，可见分布于 Marker 1.01.5 kb 的特异条带，与预计长度 1176 bp 相符(图 1)。2.2 真核质粒 pGal9 构建和鉴定将 RTPCR 扩增产物，经 Hind和 EcoR双酶切后，克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1(+)。阳性克隆送英骏公司测序，同时进一步对阳性重组质粒进行
8、PCR 和双酶切鉴定。以阳性重组质粒为模板，用前述特异性引物进行 PCR，可扩增出与预计长度 1176 bp 相符的目的片段，而空载体则为阴性结果(图 2A)。阳性重组质粒经 Hind和 EcoR双酶切后电泳，同样可见与预计长度相符的片段(图 2B)。测序结果表明，PCR 扩增获得并克隆的 Gal9 片段序列与 GenBank 中的序列完全一致(结果未附)。1 Marker;2 RTPCR product of Gal9 gene 图 1 RTPCR 扩增 Gal9基因 CDS 序列 A PCR analysis：1 Marker;2 PCR product of pGal9;3 PCR pr
9、oduct of pcDNA3.1(+);B Double restriction enzyme digestion analysis：1 Marker;2 pcDNA3.1(+)dynamitin digested with Hind and EcoR;3 pGal9dynamitin digested with Hind and EcoR。 图 2 真核表达质粒 pGal9 的 PCR 和双酶切鉴定3 讨论半乳糖凝集素家族(galectin family)是含有一个保守糖识别域的 半乳糖苷结合凝集素。半乳糖凝集素家族有 15 名成员，广泛参与许多生理和病理过程，包括细胞间黏附、细胞生长调节
10、、RNA 转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等1,2。 半乳糖苷结合凝集素9(Gal9) 是一种糖结合蛋白，属于 alectin 家族成员，组织分布广泛，具有多种生物学活性，参与细胞聚集和粘附、增殖、死亡和调节炎症及免疫反应等多种生理和病理过程3。为进一步研究Gal9 的作用机制，我们通过 DNA 重组技术和 PCR 方法从人外周血单个核细胞克隆 Gal9 基因，插入真核表达载体 pcDNA3.1(+)中，构建了包含 Gal9 基因的真核表达载体 pGal9 。为鉴定真核表达载体pGal9 ，以阳性重组质粒为模板，用前述特异性引物进行 PCR，证明获得的真核表达载体 pG
11、al9 可扩增出与预计长度 1176 bp 相符的目的片段，而空载体则未见 PCR 扩增产物。获得的真核表达载体 pGal9 经Hind和 EcoR双酶切后电泳，同样可见与预计长度相符的片段。测序结果证明，PCR 扩增获得并克隆的 Gal9 片段序列与 GenBank 中的序列完全一致。通过上述实验可以证明我们成功构建并获得了包含 Gal9 目的基因的真核表达载体 pGal9 。在 Gal9 当初被发现时，引人注意的是 ECA 活性4，然而随着研究的不断深入，Gal9 越来越多的生物学功能被人们所了解，这使得人们对 Gal9 乃至整个 galectin 家族的兴趣日益浓厚。研究发现，Gal9
12、通过诱导 Th1 细胞凋亡，抑制 Th17 细胞的产生，增加调节性 T 细胞的生成，来改善小鼠自身免疫性疾病模型的严重性，如实验性脑脊髓炎(EAE)5和胶原性关节炎(CIA)6。相信今后的免疫学研究方向不仅关注于 galectin 家族的其他成员，还将对 Gal9 发挥作用的具体机制，尤其是对免疫系统的影响作进一步深入探讨，从而使 Gal9 作为免疫病理性疾病治疗的新的靶点成为可能。综上所述，我们成功克隆了能够正确表达 Gal9 目的基因的真核表达载体 pGal9 ，为进一步研究的 Gal9 功能提供方便，并为进一步探讨 Gal9 对免疫系统的影响奠定了基础。【参考文献】1Elola MT,
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