1、瘢痕疙瘩真皮-表皮连接区结构的组织形态学变化作者：姜笃银 陈璧 贾赤宇 董茂龙 徐明达 【关键词】 瘢痕疙瘩 关键词: 瘢痕疙瘩;基底膜;免疫组织化学;组织形态学 摘 要:目的 观察瘢痕疙瘩（Ks）真皮表皮连接（DEJ）区结构变化. 方法 对瘢痕疙瘩浸润部、增生部和老化部及其正常皮肤（NS）标本，采用组织学、免疫组化 laminin，vWF 标记和 DEJ 区结构扫描电镜观察. 结果 DEJ 区 laminin 和基底膜厚度、真皮乳头密度和乳头间孔穴密度，表皮内面基底细胞质膜皱襞密度、孔穴密度及其粘附细胞密度（EACD） ，真皮乳头层微血管密度（MVD）等指标，各组均有显著的病理改变.统计学处
2、理:浸润部增生部老化部或（和）正常皮肤（t，P0.050.01）.除真皮乳头和基底细胞质膜皱襞密度外，MVD或 EACD 与其他指标的均数间呈明显正相关（t，P0.050.001，r=0.3720.681）. 结论 Ks 不同部位 DEJ 区结构有显著不同的病理改变，可能与真皮乳头的微血管增生和阻塞及免疫细胞向表皮内大量浸润有关. Keywords:keloid;basement membrane;immunohis-tochemistry;histomorphology Abstract:AIM To observe the construction change of der-mal-ep
3、idermis junction（DEJ）in keloids（Ks）.METHODS Histology，immunohistochemical labeling（laminin and vWF）and scanning electronic microscope were applied to investigate the invasiving zone，proliferative zone，aged zone of keloids and normal skin specimen.RESULTS There were marked pathological changes in lam
4、inin of DEJ，thickness of basal membrane，dermal papilla density，hole density in papillas，fold density of basal cytoplasmic membrane，hole density and adherence cell density，microvessel density in papilla layer of dermal，invasiving zoneproliferative zoneaged zone and NS（t，P0.050.01） ，except dermal papi
5、lla and fold density of basal cytoplasmic membrane，such indexes as MVD and EACD are positively related to each other（tr ，P0.050.001，r=0.3720.681）.CONCLUSION Marked-ly different pathological change of DEJ appeared in different zone of keloids，and that may be related to proliferation and occlusion of
6、microvessel in dermal papilla layer and infiltra-tion of immune cells in epidermis. 0 引言 瘢痕疙瘩（keloids，Ks）是易感个体皮肤外伤愈合等后在水平和垂直两个方向上结缔组织过度增生而形成的真皮良性肿瘤.组织学上瘢痕疙瘩与增生性瘢痕相似，均呈现纤维细胞增生和胶原大量沉积.由于具有侵袭性生长的特性，因而又赋予它与一般增生性瘢痕不同的临床表现和病理过程，即典型的瘢痕疙瘩由外向内可分为浸润部、增生部和老化部1 .瘢痕疙瘩上述 3 个不同部位是由正常皮肤逐渐发展而成的.有关瘢痕疙瘩的真皮-表皮连接（dermal
7、-epi-dermis junction，DEJ）区结构的病理改变未见文献报道.为此，我们收集瘢痕疙瘩不同部位标本，通过组织学、Laminin（LN）和 von Willerbrand factor（vWF）免疫组化标记和扫描电镜（SEM）观察，探讨瘢痕疙瘩 DEJ 区组织形态学变化及其发生机制. 1 对象和方法 1.1 对象 瘢痕疙瘩标本均取自我院门诊和住院手术患者 23（男9，女 14）例，年龄 245 岁.其中胸骨柄区 9 份，面颈部 2 份，肩三角肌和上背部 7 份，耳垂部 5 份.瘢痕疙瘩标本取材分成中央凹陷的老化部15 份;表面潮红隆起的增生部 23 份及其与正常皮肤交界的浸润部
8、13 份;留边缘正常皮肤（NS）10 份为对照.除电镜标本外，新鲜标本用40gL-1 多聚甲醛缓冲液固定，石蜡包埋. 1.2 方法 1.2.1 组织学观察 连续 5m 组织切片，分别作 HE，PAS 染色，观察 DEJ 区乳头、皮钉和基底膜（BM）结构.用目镜尺测微器测定各标本 5个不同部位的 BM 厚度（m）和乳头密度（个/mm2 ） ，取均值. 1.2.2 免疫组化染色和观察 5m 石蜡切片捞于 APES 胶包被的载玻片上.常规设 PBS 和山羊血清代替第一抗体的阴性对照.所有标本采用SP（kit，福建 Maxim 公司）方法作鼠抗人 LN IgG（福建 Maxim 公司）和兔抗人 vWF
9、 IgG（DAKO）免疫组化标记，DAB 显示棕黄色阳性信号，分别定位于 BM 和微血管内皮细胞（mVEC）胞质，背景淡黄或无色.观察:乳头浅层 mVEC 增殖水平及血管结构（BM 和管腔）;DEJ 区 BM 结构;高倍镜（400）下采用目镜网格测微器（5/25）观察 10 份标本的各 5 个单位面积内微血管与网格交叉点数的平均数，以此代表微血管密度（MVD，交叉点数/mm2 ）;测定 DEJ 区 LN 和 BM 各 5 点的厚度（m） ，取均值. 1.2.3 SEM 样本制作2 和观察 每组各 5 块新鲜组织，修成1.0cm1.0cm0.3cm 大小，PBS（pH7.4）冲洗后入 1.25g
10、L-1 dispase（日本）消化液内 424h，小心分离表皮和真皮，直接置入40mLL-1 戊二醛-多聚甲醛液内固定，按常规方法3 制成SEM 样本，JSMT-200 扫描电镜观察.采用 SEM 上的标示尺计算单位面积（mm2 ）内真皮表面乳头密度（DPD） 、真皮孔穴密度（DHD） ，表皮内面的波纹状皱襞密度、表皮孔穴密度（EHD）及其表皮粘附细胞密度（EACD）的平均数. 统计学处理:各组计量资料 t 检验，微血管密度和粘附细胞密度与 Ks DEJ 区结构相关的指标之间作单因素相关分析和 r 值和 t 检验. 2 结果 2.1 光镜观察 正常皮肤组表皮各层细胞分化良好，层次清楚，基底细胞
11、均匀排列于锯齿状 BM 上，乳头和皮钉或腺嵴的纵轴与表皮垂直，大小对称，分布规律，BM 粗细均匀、连续.浸润部:表皮明显增厚（有1320 层表皮细胞） ，细密的基底细胞紊乱地排列于增厚、断裂、松散或分层的 BM 上，部分 BM 已与基底细胞分离，散落于乳头基质中，倾斜的乳头和皮钉增宽变浅，乳头数量减少，乳头内血管 BM 增厚、阻塞.增生部组:表皮变薄，细胞分化差，DEJ 区 BM 粗细不均，于乳头和皮钉交界处明显增厚、分层，有断裂现象（Fig1） ，乳头或皮钉明显减少.老化部组:表皮 变薄，乳头和皮钉近乎消失，BM 变薄、呈断续状.各组光镜下真皮乳头密度（个/mm2 ）为:NS（6.60.5）
12、浸润部（4.00.5）增生部（1.80.4）老化部（0.40.1） （t，P0.001） ，各组 BM厚度（m）依次为:浸润部（2.90.5）增生部（2.30.3）老化部（1.50.2）和 NS（1.60.2） （t，P0.01）. 2.2 免疫组化观察 2.2.1 正常皮肤 LN 分布于含 BM 的部位，以 DEJ 区 BM 显色最强，于表皮基底细胞底部呈线状均匀着色，位于皮肤附件周围和 mVEC 底部及LN 较纤细.上述各部位的 LN，在疤痕疙瘩均有不同程度的病理改变，非BM 部位的胶原组织内也有团索状轻度着色.浸润部:DEJ 区 LN 粗细不均，于真皮侧着色，有裂隙或间断、疏松或分层和剥
13、脱等表现.LN 增粗部位多见于乳头和皮钉交界部位，乳头内毛细血管 BM 增厚、闭塞或改建.萎缩或退变的皮肤附件周围 LN 染色弱或消失;增生部:DEJ 区 LN 平直，粗细不均，厚度较浸润部下降，但真皮组织内非特定部位 LN 着色明显增强;老化部:LN 呈点线状着色不均，残留在极少数正常皮肤附件的外周，LN 着色与正常皮肤相近.各组 LN 厚度（m）依次为:浸润部（1.80.4）增生部（1.20.2）NS（0.90.1）和老化部（0.70.2）（t，P0.01）. 2.2.2 正常皮肤 vWF 乳头层微血管粗细相近、分布规律，由乳头层呈垂直走向终止于乳头内;浸润部:浅层微血管扩张、分布不规律，
14、乳头内 mVEC 向管腔内外增生，毛细血管大多闭塞或改建，微血管数量和密度均明显增加;增生部:浅层微血管高度扩张，多数因 mVEC 增生紊乱或管壁扭曲致管腔梗塞，其血管内外均可见 mVEC，乳头部位的毛细血管密度降低或消失;老化部:微血管数量、密度和病理改变均明显减少.NS，浸润部，增生部和老化部乳头层 MVD 值（x s）依次为:30248，41693，37261 和 28141.统计学 t 检验结果为浸润部增生部（P0.05）NS 和老化部（P0.001）. 2.3 SEM 观察 2.3.1 正常皮肤真皮表面结构 乳头大小均匀、排列整齐，呈圆柱状，高耸垂直，顶端钝圆，表面有波纹状 BM 覆
15、盖;乳头之间的峡谷区也覆盖着网状的 BM（Fig2） ，其间有直径 530m 的孔穴，散在分布，未见 BM 覆盖;浸润部:乳头排列尚均匀，但乳头逐渐萎缩变小、倾斜或倒伏，皱缩的乳头呈叶片样卷曲（Fig3） ，增宽的乳头间区域 BM 粗细不均、分布少量的无 BM 覆盖的孔穴，直径约 5.0120m，偶见汗腺管突出于此;增生部:乳头枯萎、稀少，完全倒伏于真皮表面，乳头间孔穴数量较浸润部少;老化部:典型的乳头几乎消失，真皮表面平坦，孔穴大小和数量明显降低.各组真皮表面乳头密度和真皮乳头间孔穴密度比较，结果（Tab1）分别为:正常皮肤浸润部增生部老化部（t，P0.001）;浸润部增生部（t，P0.05
16、）老化部NS（t，P0.001）. 图 1 图 6 略 2.3.2 正常皮肤表皮内面结构 有与乳头大小和外形相近、分布均匀的乳头孔，基底细胞呈螺旋状排列，其表面有与细胞排列方向平行一致的波纹状皱襞（注:为基底细胞真皮侧的质膜皱褶） ，可见散在孔穴和与表皮相连的皮肤附件结构;浸润部:与正常皮肤的移行部，乳头孔外形和大小接近 NS，孔内有膜片状结构附着，向增生部移行部位的乳头孔较正常小而浅，孔内多有分层的膜片状结构（Fig4） ，与光镜下（PAS 特殊染色）所见增厚分层的 LN 结构十分相似;膜表面有细颗粒状结构凸出，膜下呈松散网状结构，与丰富的基底细胞膜皱襞相连接，皱襞常成双并列伸向真皮侧，异常
17、增厚和致密（Fig5） ，整个表皮内面有密集的直径约530m 的细小孔穴，可见较多直径约 1012m 球形和树突状细胞粘附（Fig4）;增生部:乳头孔逐渐减少、消失，细长的波纹状皱襞平行排列，相间细小孔穴，其数量和粘附细胞均较浸润部少.在浸润部（多见）和增生部孔穴部位基底细胞表面可见大小均匀、直径约 0.5m 的囊胞状结构（vesicular structure）凸向孔穴，中央可见细小凹陷（Fig6）;老化部:典型乳头孔已完全消失，表面平坦，波纹状皱襞稀少、分布不规律，孔穴变小、密度下降.统计学 t 检验（Tab1） ，表皮内面皱襞密度（EFD）依次为:浸润部增生部（P0.001）老化部NS（
18、P0.05） ，表皮内面孔穴密度（EHD）依次为:浸润部增生部老化部NS（P0.001）.表皮内面粘附细胞密度依次为:浸润部增生部老化部NS（t，P0.001）. 表 1 瘢痕疙瘩各部位 DEJ 区结构密度比较 略 瘢痕疙瘩各部乳头层（瘢痕浅层）MVD 或 EACD 与 DEJ 区 BM 和 LN 厚度、DPD，DHD，EFD，EHD 均数作单因素相关分析，r 值和 t 检验结果如Tab2，除 DPD 和 EFD 外，MVD 或 EACD 与 DEJ 区结构病理改变呈明显正相关. 表 2 瘢痕疙瘩 EACD 或 MVD 与 DEJ 区结构密度的相关性分析 略 3 讨论 我们采用 dispase
19、分离表皮和真皮（或瘢痕）后，按常规制作显示DEJ 区结构的 SEM 样本2 ，能非常清晰地显示真皮表面和表皮内面的细微结构，包括:真皮乳头、乳头间孔穴及其表面覆盖的 BM，表皮内面的乳头孔、孔间隆起区域（相当于光镜下皮钉部位） 、表面孔穴及其表面粘附细胞和基底细胞质膜形成的波纹状皱襞.说明此方法是可靠的，能同时获取 DEJ 区真皮和表皮连接的两个层面上的信息资料. 临床和组织学将瘢痕疙瘩分为浸润部、增生部和老化部 3 个不同部位1 .光镜和 SEM 水平观察上述三者 DEJ 区结构有明显的区别:瘢痕疙瘩浸润部组织形态学变化最为明显，BM 和 LN 表现增厚、分层、断裂或与基底细胞剥离，真皮乳头
20、萎缩、倒伏和密度锐减，表皮内面孔穴及其粘附细胞密度增加，基底细胞表面皱襞发达;瘢痕疙瘩增生部 DEJ 区结构变化是瘢痕疙瘩浸润部的延续，但各项指标均明显下降;瘢痕疙瘩老化部总体表现为萎缩或老化.纵观 DEJ 区 BM 和 LN 厚度、真皮表面的乳头密度和孔穴密度、表皮内面的皱襞密度、孔穴密度和粘附细胞密度，以及瘢痕浅层的微血管密度等指标，在瘢痕疙瘩浸润部、增生部和老化部 3 个部位呈明显下降趋势（P0.050.001） ，除真皮表面乳头密度和表皮内面皱襞密度外，微血管密度或表皮内面粘附细胞密度与其他指标的均数间呈明显的正相关（P0.050.001）.结合我们对瘢痕疙瘩角朊细胞（包括表皮细胞和附
21、件上皮细胞）的免疫介导作用的研究结果（另文报道） ，表明瘢痕疙瘩 DEJ 区组织形态学的改变，可能由表皮和真皮（或瘢痕浅层）的多方面因素共同决定的.其中瘢痕疙瘩浸润部的浅层组织内大量免疫细胞浸润，毛细血管增生性闭塞和改建4 ，可能是引发 DEJ 区结构破坏的主要病理基础.瘢痕疙瘩早期乳头内毛细血管阻塞和表皮内免疫细胞浸润，使乳头萎缩甚至消失，并使 BM 断裂失去乳头的支撑（持）作用，从而出现分层和剥脱.BM 增厚（乳头和皮钉交界部多见），可能与 BM 损伤后丧失过滤作用或免疫细胞浸润和反复刺激5 、上调基底细胞的功能等有关.由此提示，乳头内毛细血管对乳头和 BM 正常结构的维持具有重要作用.从
22、另一角度看，真皮乳头内原有的正常毛细血管分布格局的丧失，可能也是皮钉和乳头逐渐消失的重要因素之一.BM 的厚度随 LN 厚度的变化而变化，提示 LN 可能是瘢痕疙瘩 BM 病理变化的主要成分. 正常皮肤的真皮乳头间区域可有孔穴形成，能容淋巴细胞5 和郎格罕细胞通过.瘢痕疙瘩真皮表面和表皮内面的孔穴及其粘附细胞数量比正常皮肤明显增多，说明免疫细胞（淋巴细胞、郎格罕细胞等）通过这些孔穴来往于 DEJ 区，参与 DEJ 区结构破坏和瘢痕增生过程.早期表皮内面孔穴处的基底细胞表面有直径约 0.5m 的囊泡状结构，其中央可见细小凹陷，可能与细胞的外分泌颗粒及其释放有关，对调节免疫细胞的趋化和粘附具有一定的作用.上述结果为首次发现.瘢痕疙瘩乳头间区域可见比正常皮肤更多的无 BM 覆盖的孔穴，与盘状红斑狼疮和扁平苔癣有相似之处6 ，而 LN 或 BM 组织形态学改变与获得性大疱性表皮松解症和瘢痕性类天疱疮等7 十分相似，提示瘢痕疙瘩与许多其他皮肤病有相似的发病机制，BM 也成为自身免疫反应的靶器官，值得我们进一步研究.
