1、白色念珠菌细胞壁 -葡聚糖升白细胞药效学作用的研究【摘要】 目的 研究白色念珠菌（Candida Albicans）细胞壁不同溶解性的 -葡聚糖（-glucan）对环磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致小鼠外周血白细胞减少的回升作用。方法 采用 CTX 所致的小鼠外周血白细胞减少模型，研究白色念珠菌细胞壁 -葡聚糖对小鼠外周血白细胞数的影响。结果 三种溶解性的白色念珠菌细胞壁 -葡聚糖均能升高小鼠外周血白细胞、中性粒细胞和单核细胞数。各组小鼠脾脏指数增加，脾脏、骨髓巨核细胞系增生。不溶性的 -葡聚糖作用更明显。结论 白色念珠菌 -葡聚糖尤其是不
2、溶性 -葡聚糖对 CTX 所致的白细胞减少有回升作用，是一种很有前途的免疫调节剂。【关键词】 白色念珠菌；-葡聚糖；生物学活性；提取分析；免疫药理作用【Abstract】 Objective To study the pharmacological effect of the basic -glucan，acidic -glucan and insoluble -glucan extracts of Candida albicans on the leukocytopoiesis-promoting in the leukopenia mice.Methods Mice of each gro
3、up except the untreated control group were administered cyclophosphamide intraperitoneally 100 mg/(kgd) for three days to develop leucopenia.The experimental group were administered three kinds of Candida albicans -glucan intravenously for six days separately.The peripherial leukocytes of all mice w
4、ere counted before treated CTX，and 1，3，5，7 days after treated CTX.Results Three kinds of Candida albicans -glucan can increase the numbers of leukocytes，neutrophilic granulocytes and monocytes in the peripheral blood.The spleen index in each group animal are increased，and megakaryocytes are increase
5、d in spleen and marrow.Conclusion Candida albicans -glucan specially insoluble -glucans is a kind of immunomodulator which can increase the numbers of leukocytes in the peripheral blood.【Key words】 -glucan；Candida albicans；leukocyte；immunomodulator-葡聚糖（-glucan）是白色念珠菌细胞壁中含量最高的多糖。作为一类条件致病真菌多糖，白色念珠菌 -葡
6、聚糖有着多种生物学活性和免疫药理学作用，在抗炎、抗肿瘤、刺激造血等方面都有很高的药效学作用1 ，但有关不同性质的白色念珠菌 -葡聚糖升白细胞作用的研究甚少。本研究制备三种溶解性的 -葡聚糖，观察其对环磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致的小鼠外周血白细胞减少的回升作用，为进一步确证白色念珠菌 -葡聚糖刺激造血系统使白细胞升高的作用机制，和进一步研究白色念珠菌 -葡聚糖有效成分或有效因子，为确立药物质量控制标准和量效关系提供理论依据。1 材料与方法1.1 动物与试剂 昆明种小白鼠，46 周龄，体重 202g，昆明医学院动物科（云南省实验质量合格证
7、 0000481 号） 。沙氏液体培养基（Sabourauds dextrose agar）：蛋白胨 10g、葡萄糖 40g、溶于1000ml 蒸馏水，高压灭菌后备用； 淀粉酶：分子量9600，酶活力：50/mg（上海伯奥生物科技有限公司） ；白色念珠菌碱溶性 -葡聚糖（Candida albicans basic -glucan， CABBG） 、酸溶性 -葡聚糖（Candida albicans acidic -glucan， CAABG)和不溶性 -葡聚糖（Candida albicans insoluble -glucan， CAIBG）：均按文献方法制备2 。1.2 仪器 LRH-2
8、50Z 型震荡培养箱（广东医疗器械厂） ；81-2 型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂） 。1.3 白念珠菌的培养和三种白色念珠菌 -葡聚糖的制备 取少量保存于密封无菌容器中的纯白色念珠菌菌落，接种于沙氏液体培养基，接种后 37恒温摇床 160 次/min 震荡培养 67 天，3000rpm 离心30min，收集菌体，冷冻保存。提取 葡聚糖的流程，见图 1。1.4 小鼠白细胞减少模型的建立 除空白对照组外，各组小鼠腹腔注射 CTX 100mg/(kgd)，连续 3 天，建立小鼠外周血白细胞减少模型。1.5 确定三组 -葡聚糖的给药剂量 参照急性毒性实验摸索 LD50值，各组给药剂量最后如表 1。
9、1.6 统计学处理 急性毒性学实验结果采用 Bliss 法计算 LD50 值。药效学实验采用 SPSS11.5 统计软件进行数据处理分析，所有指标均以均数标准差（xs）表示，组间比较采用方差分析，以 P0.05 为差异有显著性。 图 1 从白色念珠菌提取 CABBG、CAABG、CAIBG 的流程示意图Table 1 Dose design of experiment 2 结果2.1 急性毒性学实验 通过急性毒性实验得到 LD50 值分别为：CABBG 36.8937mg/kg，CAABG 89.23549mg/kg，CAIBG 767.7753mg/kg；95%可信区间分别为 CABBG 组
10、32.005242.5289mg/kg，CAABG 组 76.7182103.8025mg/kg，CAIBG 组663.748888.106mg/kg。各实验组小鼠肉眼观察，除肝脏增大外未见明显变化，病理 HE 切片显示肝细胞有不同程度的肿胀和空泡变。2.2 外周血白细胞变化 实验第 5、7、9 天 CABBG、CAABG、CAIBG组小鼠外周血白细胞数、中性粒细胞数、单核细胞数均显著增高，其中第 7 天、第 9 天，CAIBG 组白细胞数、单核细胞数较阳性对照组 rhG-CSF升高，差异有显著性。Table 2 Numbers of leukocyte of peripheral blood
11、 in each group animal (xs) 注：Note：*P0.05，compared with the normal control；*P0.05，compared with the positive controlTable 3 Numbers of neutrophilic granulocyte of peripheral blood in each group animal (xs) 注：Note：*P0.05，compared with the normal control；*P0.05，compared with the positive control Table
12、4 Numbers of monocyte of peripheral blood in each group animal (xs) 注：Note：*P0.05，compared with the positive control2.3 脾脏、胸腺指数变化 实验第 5、7、9 天，各组小鼠胸腺指数比较，差异无显著性(P0.05)。各组小鼠给药后，脾脏指数均增加。 Table 5 The effect of -glucan on the spleen index in each group animal (xs)注：Note：*P0.05，compared with the positive
13、control 2.4 药效学实验病理组织学改变 脾脏：白髓、红髓分界不甚清楚，红髓内细胞数增多，与空白对照组比较，CABBG、CAABG、CAIBG 组脾窦出现较多的巨核细胞；骨髓：实验组小鼠骨髓细胞增生活跃，与空白对照组比较，CABBG、CAABG、CAIBG 组的巨核细胞数增多，提示巨核细胞系增生活跃。3 讨论多能造血干细胞具有多向分化的潜能，成年小鼠体内的多能造血干细胞主要分布在脾脏和骨髓3 。本研究显示，实验第 7 天时，各实验组白细胞总数、中性粒细胞数都较 rhG-CSF 高(P0.05)；实验第 7 天、第 9 天，CAIBG 升高外周血白细胞、单核细胞数明显高于 CABBG、C
14、AABG和 rhG-CSF(P0.05)，说明 -葡聚糖，尤其是 CAIBG 可刺激血液系统白细胞、中性粒细胞、单核细胞数不同程度的升高。实验第 7 天，CABBG、CAABG、CAIBG 组小鼠脾脏指数均与 rhG-CSF 差异有显著性(P0.05)；第 9 天，CAIBG 脾脏指数较 rhG-CSF、CABBG、CAABG 组高，统计学表明差异均具有显著性(P0.05)。与成年小鼠体内造血干细胞的分布一致，实验发现 CABBG、CAABG、CAIBG 组小鼠的组织病理学改变主要体现在骨髓和脾脏。与空白对照组比较，三组小鼠脾脏、骨髓巨核细胞数增多，CAIBG 组要更明显。因此，综合外周血细胞
15、数、脾脏指数、组织改变，我们推测 -葡聚糖在刺激小鼠外周血白细胞总数升高的过程中可能与刺激 CFU-S 增殖，向粒系、巨核系组细胞分化，进而生成粒细胞、单核细胞。造血器官中基质细胞是造血微环境中重要的成分，与造血有关的基质细胞涉及到巨噬细胞、成纤维细胞、网状细胞、淋巴细胞、内皮细胞和载脂肪细胞。其中，巨噬细胞被证明是在造血发生过程中有重要作用的一个微环境因素。巨噬细胞可通过细胞相互作用和分泌CSF、Epo、BPA、PGE 和 IL-1 因子，调节所有四系血细胞的生长和分化4 。以往研究证实念珠菌多糖可刺激巨噬细胞释放细胞因子（CK）如IL-6、IL-8、IL-1、TNF 等5，6 。这些细胞因
16、子可调控造血细胞的增殖活动：IL-1、TNF 可刺激内皮细胞产生粒细胞集落刺激因子（G-CSF）及粒-巨噬系集落刺激因子（GM-CSF） ，G-CSF 和 GM-CSF 是使粒细胞和单核细胞的母细胞增殖分化的特异性诱导剂，并能刺激骨髓向外周血液释放成熟的中性粒细胞，缩短中性粒细胞的成熟期7 。同时，CSF 可作用于粒-单系祖细胞（CFU-GM） ，诱导其增殖分化。IL-1 还能激活干细胞从G0 期进入增殖周期，扩大干细胞池；可为早期干细胞对 CSF 起反应做准备，并诱导辅助细胞产生 CSF 及其他 CK，从而间接调节造血。-葡聚糖是念珠菌重要的抗原决定簇8 ，单核细胞、巨噬细胞上都存在 -葡聚
17、糖的特异性受体9 。白色念珠菌的三种溶解性的 -葡聚糖，在结构上都是符合单核细胞、巨噬细胞上 -葡聚糖受体对于配体的要求，即能被特异识别 -（13）和 -（16）糖苷键10 。巨噬细胞作为一类抗原递呈细胞（APC）摄取 -葡聚糖抗原，随后诱导性的表达高水平 MHC，MHC 与 Th 细胞上的 TCR 和 CD4 相互作用。使 Th 细胞功能增强，IL-2 分泌增多，IL-2 又能保持 T 细胞的存活与增殖 Th 细胞被激活后刺激 B 细胞分化、增殖11 。实验中，小鼠脾脏指数的明显增加、脾脏、骨髓细胞增生，说明了 -葡聚糖在升高外周血白细胞的同时，也对激活机体的整个免疫系统活性产生影响。因此，
18、CAABG、CABBG、CAIBG 升高小鼠外周血白细胞总数、中性粒细胞和单核细胞的作用可能与各组 -葡聚糖能不同程度的被单核、巨噬细胞识别从而产生一系列细胞因子，刺激造血系统和促进中性粒细胞增殖有关。免疫调节剂作为一种免疫治疗的药物已经广泛应用于临床。多糖作为一类免疫调节剂，不仅毒副作用小，资源丰富，而且具有明显的调节机体免疫系统的作用。本研究说明白色念珠菌 -葡聚糖尤其是不溶性的-葡聚糖能显著增加小鼠脾重，并能对抗由 CTX 所致的小鼠脾脏萎缩及白细胞水平降低，是一种较好的免疫增强物质。【参考文献】1 Kouki Ishitani.Antitumor activity of polygal
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