1、fat1 转基因小鼠的构建与鉴定【摘要】 目的 构建和鉴定携带有外源 fat1 基因的转基因小鼠。方法 将 fat1 基因的 cDNA与动物表达载体 pEFneo 连接，构建pEFfat1 重组质粒, 酶切、测序鉴定正确后，以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠，通过 PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的 G0代小鼠。结果 成功构建了 pEFfat1 重组质粒，将其显微注射到小鼠受精卵中，得到 G0代小鼠，PCR、Southern blot杂交确立了 4只整合有 fat1 基因的首建鼠。结论 fat
2、1 基因可整合到小鼠体内，得到的转基因小鼠为研究 fat1 基因的生物学功能提供了动物模型。 【关键词】 小鼠 转基因 DNA 重组 fat1 基因 ABSTRACTObjectiveTo construct and identify the transgenic mice with extrinsic fat1 gene. MethodsFat1 cDNA and animal expression vector pEFneo were conjugated to construct the recombinant plasmid pEFfat1 which was digested by
3、restrict enzyme and sequenced correctly. The obtained linear recombinant plasmid pEFfat1 was microinjected into the arsenoblasts of mouse zygote, which was implanted into the uterus to produce transgenic mice. PCR and Southern blot were performed to identify the positive G0 generation of fat1 transg
4、enic mice. ResultsRecombinant plasmid pEFfat1 was successfully constructed and four G0 mice with integrated fat1 gene were identified via PCR and Southern blot.ConclusionFat1 gene can be integrated into mouse to obtain the transgenic mouse that provides an animal model for the study of fat1 gene. KE
5、Y WORDSmice, transgenic; DNA, recombinant; fat1 gene fat1 基因来源于小秀丽线虫，SPYCHALLA 等1利用在阿拉伯芥（Arabidopsis）中进行异种表达的方法确认了 fat1 cDNA的序列。此 cDNA 的翻译产物是由 402个氨基酸组成的 n3 多聚不饱和脂肪酸（PUFAs）脱氢酶，相对分子质量为 4.64万，是氧离子依赖的含铁酶，属于跨膜蛋白超家族。此酶的功能是以 1620 碳的 n6 PUFAs为底物进行脱氢反应，生成相应的 n3 PUFAs。体外实验表明， fat1 cDNA的表达可促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，保
6、护神经细胞，并可改变细胞膜 n6/n3 PUFAs的比例，降低来源于 n6 PUFAs的类花生酸的组成 27 。本文旨在构建和鉴定 fat1 转基因小鼠，从而为fat1 基因在动物整体水平上的研究提供实验模型。 1 材料和方法 1.1 材料 菌株 XL1Blue 及 pEFneo 质粒由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供。pcDNAfat1 质粒(内含 fat1 cDNA)由本室保存。各种限制性内切酶、DNA 分子质量标准 DNA/EcoR+Hind及 T4 DNA连接酶等均购自 Promega公司；PCR 引物由上海生工公司合成，DNA 测序由北京三博远志生物公司完成。琼脂糖购自华美生物工
7、程公司。DNA 凝胶回收试剂盒购自 Omega公司。其他试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 重组质粒 pEFfat1 的构建 pcDNAfat1 及表达载体pEFneo 用 EcoR/Xba进行双酶切，8 g/L琼脂糖凝胶电泳，分别回收、纯化 1.3 kb片段和大片段。将 1.3 kb的目的片段和载体片段以摩尔比 31 连接，转化感受态大肠杆菌 XL1Blue 后，用小量碱裂解法提取重组质粒。 1.2.2 重组质粒 pEFfat1 的鉴定 据相应酶切图谱，上述提取的重组质粒分别用 EcoR/Xba、Bgl、Xho进行酶切鉴定，将阳性重组子命名为 pEFfat1 。 1.2.3 重组
8、质粒 pEFfat1 的序列测定 将酶切鉴定为阳性重组子的 pEFfat1 送交北京三博远志生物公司进行全自动序列测定。 1.2.4 转基因小鼠的获得 pEFfat1 经 Spe/BamH双酶切后，8 g/L琼脂糖凝胶电泳分离回收 5.5 kb的大片段，纯化，最后溶解于微注射缓冲液（内含 10 mmol/L Tris HCl ，pH 8.0，0.1 mmol/L EDTA）中，并准确调整 DNA至 3 mg/L，以 3 pL的量注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中。小鼠为清洁级昆明白小鼠。1.2.5 转基因小鼠的整合检测 提取 46 周龄 G0代转基因小鼠尾尖 DNA，
9、用 PCR法测定 G0代转基因动物的整合情况。所用引物为:上游5GTAGCCT TGCAGAAGT TGGTCG3 ；下游 5GACG G AAAGCATCCACAGTTGG3 。 扩增条件为：94 、3 min,94 、40 s,55 、40 s ，72 、1 min,72 、8 min,30个循环, 扩增出的片段大小为 440 bp。经 PCR检测阳性的小鼠再经 Southern blot杂交做进一步确定。探针为 pEFfat1 ，经 Spe/BamH双酶切获得。 1.2.6 转基因小鼠的饲养和繁育 小鼠的饲养条件为清洁级。将 G0代转基因小鼠与正常小鼠交配产生 G1代小鼠。根据遗传规律，
10、鉴定至第5代时将得到稳定遗传的转基因小鼠。 2 结 果 2.1 重组质粒 pEFfat1 的酶切鉴定及 DNA序列测定 重组质粒分别经 EcoR/Xba、 Bg、Xho酶切鉴定，结果与原来载体和目的基因所带的限制性酶切位点相符。见图 1。重组质粒pEFfat1 的测序结果表明，载体与 fat1 cDNA接头部分及 fat1 cDNA本身序列均正确，无碱基突变。 2.2 转基因小鼠的获得 将 pEFfat1 经 Spe/BamH双酶切后回收纯化的片段显微注射到小鼠受精卵的雄原核中。共注射并移植受精卵 738枚，存活的受精卵为 486枚，将存活的受精卵移植到假母，成活的假母数为 48只，最后生下
11、42只 G0代小鼠。 2.3 PCR检测阳性 G0代小鼠 以上述 42只 G0代鼠尾 DNA为模板，作 PCR检测，共检测出阳性小鼠 11只。部分结果见图 2。 2.4 Southern blot检测阳性 G0代小鼠 取 PCR阳性样品作 Southern blot杂交，结果显示有 4只 G0代小鼠基因组中整合有目的基因。见图 3。将此阳性整合有外源基因的 G0代转基因小鼠与正常小鼠交配产生 G1代小鼠。 3 讨 论 许多研究发现， n6 PUFAs可促进动物肿瘤的生长，而 n3 PUFAs则能抑制动物肿瘤的生长。临床研究显示，给乳癌和直肠癌病人的饮食中添加 n3 PUFAs，可减轻或抑制肿瘤
12、的发展8,9 。补充 n3 PUFAs对炎症和自身免疫病，如关节炎，具有治疗效果10 。因此,n3 PUFAs已日益成为研究的热点，人们更加注意到它作为药物和营养类化合物的价值。 另一些研究表明,对于维持细胞的稳态和正常生长起关键作用的是n6/n3 PUFAs的比例，而不是两者的绝对值11 。仅仅通过饮食摄取足量的 n3 PUFAs的效率很低，很难满足机体的需要，这使得在哺乳动物体内迅速增加 n3 PUFAs非常困难。 n3 PUFAs或 n6 PUFAs的合成是分别通过对亚油酸（ LA）或 亚麻酸(ALA)进行一系列脱氢和延长来完成的。动物细胞缺乏脱氢酶活性，n6 和 n3 PUFAs也不可
13、相互转化。所以，ALA 及对应的延长产物（n3 PUFAs）就成为人类的必需脂肪酸。但是，一些植物和微生物具有能合成 n3 脂肪酸 ALA的基因，如 fat1 。该基因来源于小秀丽线虫，mRNA全长 1.4 kb，其功能可将 n6 PUFAs脱氢转化成相应的 n3 PUFAs。当把该基因在植物阿拉伯芥中进行表达时，通过把 n3 双键引入到 n6 PUFAs碳氢链中，能催化 n6 PUFAs转化成为 n3 PUFAs1 。 以往的研究证明，利用腺病毒介导的 fat1 基因转移，可在体外培养的动物细胞中表达，且影响细胞的功能27 。然而，fat1 基因是否能在动物体内表达并发挥类似的功能，还有待于
14、研究，为此需要建立一个 fat1 转基因动物模型。本文结果表明，fat1 基因可导入动物体内，并得到了 fat1 基因 G0代转基因小鼠，这为在动物整体水平上研究此基因功能奠定了一个实验基础。 【参考文献】 1 SPYCHALLA J P, KINNEY A J, BROWSE J. Identification of an animal omega3 fatty acid desaturase by heterologous expression in ArabidopsisJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1997 ,94(4):11421147. 2 GE Y L,
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