1、HBV 感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定【摘要】 目的：建立培养人胎肝细胞感染 HBV 后差异应答基因的消减文库，并从中克隆鉴定出新的应答基因. 方法：分别从 HBV 感染及未感染的胎肝细胞中提取总 RNA，用 SMART PCR 技术合成全长双链 cDNA，经 Rsa酶切后将感染细胞的 cDNA 分为两组，分别衔接两个不同的接头，再与未感染细胞的 cDNA 进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性 PCR，将产物与 T/A 载体连接构建成消减 cDNA 文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，挑取克隆进行筛选排除假阳性，再行序列分析，鉴定胎肝细胞感染 HBV后的差异应答基因. 结果：成功构建
2、高效消减的 HBV 感染胎肝细胞 cDNA文库，得到 158 个白色的克隆，随机选择了 128 个克隆经 PCR 扩增获得含有明确单一目的片断的克隆 99 个，长约 100400 bp，经筛选后得到70 个克隆，测序表明有 16 个差异表达的基因，其中可能的新基因有 5 个. 结论：用抑制性消减杂交技术成功建立了 HBV 感染培养人胎肝细胞的消减 cDNA 文库，为进一步大规模筛选 HBV 感染后的应答基因奠定了基础，初步筛选出的新基因片断为进一步研究宫内感染的分子机制提供了依据. 【关键词】 HBV 胎肝细胞 杂交 消减文库 克隆 0 引言 慢性乙型肝炎易形成长期免疫耐受和复杂疾病谱，从 H
3、BsAg 携带、慢性乙型肝炎到肝硬化、肝癌等，宿主对病毒的反应在发病机制中起重要作用. HBV 与宿主相互作用不仅仅发生在细胞表面，很可能是一个非常复杂的相互作用网络，HBV 与宿主组织细胞之间这种特定的相互作用决定着病毒的存活与疾病的发生、发展及转归，而这种相互作用反映在基因水平上则表现为病毒感染后宿主细胞基因表达谱的改变. 完整的 HBV 感染肝细胞基因表达谱的研究有可能使我们更深入地认识 HBV 的分子致病机制，从而发现更多、更有效的抗病毒作用靶标. 本研究我们用抑制性消减杂交技术克隆并鉴定 HBV 感染胎肝细胞后的应答基因，为阐明 HBV宫内感染的分子机制奠定基础. 1 材料和方法 1
4、.1 材料 DMEM 培养基购自 Gibco 公司， 胎牛血清购自 Highclone 公司，总 RNA 提取试剂盒购自 Promega 公司，SMART PCR cDNA 合成试剂盒、PCRSelect cDNA 消减杂交试剂盒、 Advantage2 cDNA PCR 试剂盒、PCRSelect Differential Screening 试剂盒、NucleoTrap PCR 纯化试剂盒及尼龙膜、单面乳胶胶片均购自 Clontech 公司， 32P dATP购自北京福瑞生物工程公司核酸研究室. 1.2 方法 1.2.1HBV 感染培养人胎肝细胞1-2用纤维连接素包被培养皿，将冻存的 22
5、 wk 人胎肝细胞复苏，加入经过纯化的人血清来源的 HBVDNA病毒，检测培养上清中 HBcAg 和细胞中 HBV cccDNA 同时阳性的胎肝细胞做为感染组，同时培养的未感染细胞做为阴性对照组，收集细胞进行后续的实验. 1.2.2 抑制性消减杂交用总 RNA 提取试剂盒抽提两组细胞的总 RNA,按说明书操作并进行定性定量分析. 用 SMART PCR cDNA 合成试剂盒合成长距离 ds cDNA，按说明书操作，用 CHROMA SPIN1000 进行纯化，按说明书操作. 取 36 L Rsa I 消化缓冲液和 1.5 L Rsa I 酶（166.7 nkat） ；混匀后于 37孵育 3 h
6、. 以 NucleoTrap PCR 纯化试剂盒纯化消化后的 cDNA 样品，按说明书操作，经乙醇沉淀后，溶于 6.7 L 双蒸水中，用紫外分光光度计定量，将浓度调节为 300 mg/L. 以感染细胞为检测方，以未感染细胞为驱动方，加 T4 DNA 连接酶 1 L（6.66 kat） ，分别与接头 1 和 2 连接，16 h 反应过夜后进行接头连接效率检测. 在鉴定连接效率满意 （25%）后，将连接有接头 1 和 2 的检测方 ds cDNA 1.5 L 分别与 1.5 L 驱动方 ds cDNA 在 68下杂交 8 h 后，立即将经过第一次消减杂交的两组体系混合，另加新变性的驱动方 cDNA
7、 1 L，68杂交 12 h，稀释（1200）. 取 1 L 稀释后的第二次杂交后产物做模板，在 50advantage Taq 聚合酶作用下，以接头 1 和 2 的外侧序列分别为 5及 3引物，进行第 1 次 PCR 扩增；取第一次 PCR 产物3 L，10 倍稀释后取 1 L 做模板，以接头 1 和 2 内侧序列分别为 5及 3的巢式 PCR 引物，进行第二次 PCR 扩增，并进行 PCR 产物消减效率检测. 1.2.3cDNA 消减文库的构建及 PCR 鉴定克隆取 3 L PCR 产物及 2 L 线性化质粒载体，在 1 L T4 DNA 连接酶的作用下，14反应 12 h后，-20保存.
8、 取 2 L 连接反应产物转染 200 L 感受态大肠杆菌，225 r/min 摇菌 1.5 h，取 200 L 菌液种植于含氨苄青霉素的LB/Xgal/IPTG 培养板上，37培育 18 h. 计数培养板中直径1 mm 清晰的白色及蓝色菌落数. 随机挑取 128 个白色菌落于含氨苄青霉素的 LB培养基中 37摇菌过夜，取菌液 1 L 做模板，以接头 1 和 2 内侧序列分别为 5及 3的 PCR 引物，进行 PCR 扩增，选取含有明确单一目的片断的克隆 99 个进行杂交筛选. 1.2.4 斑点杂交法进行差异筛选取鉴定过的含有单一明确目的片断克隆的 PCR 反应液 5 L 加 5 L 0.6
9、mol/L NaOH， 混匀变性； 取 2 L 新鲜变性 cDNA，分别点样于尼龙膜上；0.5 mol/L TrisCl （pH 7.6）中和，杂交炉中 70烤膜 2 h 固定. 预杂交 1 h 后加入 32P 标记的4 种探针：正向消减探针、检测相未消减探针、反向消减探针、驱动相未消减探针进行杂交过夜，加入探针的 cpm 值为 107. 洗膜后进行放射自显影，选取差异表达的克隆. 用（-20）引物测序，由北京鼎国公司代理. 2 结果 2.1 总 RNA 的定性定量分析紫外分光光度计检测检测相和驱动相胎肝细胞总 RNA 量分别为 500 和 150 g/L，A260/2801.8，10 g/L
10、 琼脂糖凝胶电泳见 RNA 的 28 S 和 18 S 亚单位十分清晰，二者比例约为1.51，证实 RNA 质优量足. 2.2SMART PCR 合成长距离 ds cDNA 在 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳上见ds cDNA 为 0.58.0 kb 的弥漫性条带. 2.3Rsa I 酶切可见 ds cDNA 由 0.58.0 kb 的弥漫性条带降解为约0.22.0 kb 的条带（图 1） ，证实酶切十分成功. 图 1Ds cDNA 样品经 Rsa I 消化前后 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳 2.4Ds cDNA 两端接头连接效率检测将连接有接头 1 和 2 的两组胎肝细胞 ds cDNA 分别
11、用 G3PDH 3, 5引物及以 G3PDH 3引物和接头上5引物进行 PCR 扩增. 结果显示两组胎肝细胞接头连接效率均50%,即 50%以上 ds cDNA 已与接头连接. 2.5 两次抑制性 PCR 后的电泳两次抑制性 PCR 后分别取 8 L 扩增产物在 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳上可见正向和反向消减后的产物为约100600 bp 的弥漫性条带,而未消减前的产物为较大分子质量的弥漫性条带（图 2）. 图 2 第 2 次 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳 2.6cDNA 消减文库消减效率鉴定消减后 PCR 产物中 G3PDH 在 28 个循环后可见弱的条带,而消减前 G3PDH 在 18 个
12、循环后即可见明显条带（图3） ，说明所构建的消减文库具有很高的消减效率. 18, 23, 28, 32: PCR 循环数. 图 3 扩增看家基因 G3PDH 检测消减效率凝胶电泳 2.7PCR 鉴定克隆中插入的目的片断 cDNA 消减文库包含 158 个白色克隆，克隆饱满清晰. 随机挑取 128 个白色克隆，用巢式引物进行 PCR 扩增后，在 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳上可见大小不等的插入片断，约100400 bp. 2.8 斑点杂交法进行差异筛选结果显示：正向杂交阳性而反向杂交为阴性或正向杂交信号比反向杂交高 5 倍以上的克隆有 70 个（图 4）. 2.9 克隆的序列分析经过差异筛选后的
13、 70 个克隆测序表明插入 cDNA片段大小为 80400 bp，部分基因为多拷贝，经 GenBank (http:/www.ncbi.nlm.gov/BLAST)检索有 11 个 cDNA 片段和已知基因同源性为 100%，其中 6 个功能已知，5 个功能未知；5 个 cDNA 片段和已知基因同源性为 50%84%，可能代表新基因(表 1). 112, AI: 样品序号. 图 4 斑点杂交筛选目的基因表 1 和已知基因完全同源的 cDNA 片段 3 讨论 目前控制乙型肝炎流行的最主要手段是用乙型肝炎疫苗进行预防接种. 随着乙肝疫苗的普遍使用，乙型肝炎的水平传播已基本得到控制，而宫内感染，新生
14、儿出生后用乙肝疫苗和特异性高效价免疫球蛋白不能阻断其传播，因而成为我们国家乙型肝炎传播的主要途径. 近几十年来，关于 HBV 宫内感染发生率的报道较多，然而对其具体机制研究较少3-6. 本研究选择胎肝细胞作为研究 HBV 宿主相互作用的模型，用抑制性消减杂交技术鉴定 HBV 感染胎肝细胞后的差异应答基因谱变化，经序列分析和同源性比较分析发现 HBV 感染胎肝细胞的过程可能涉及到物质代谢和信号传导过程. 部分功能已知的差异应答基因包括编码合成甲氨酰磷酸合成酶 1(CPS1)的基因，该酶参与催化尿素循环的起始步骤7 ；编码乳酸脱氢酶的基因，该酶为糖代谢不可缺少的酶类；编码 CD59 抗原的基因，C
15、D59 是一种广泛分布于组织细胞表面的 GPI 锚固糖蛋白，是一个重要的信号转导分子8 ；编码 3 甲基3 羟基戊二酸辅酶 A 合成酶(HMGCoAs) 的基因,该酶与胆固醇和酮体的代谢有关9 ；编码核受体结合蛋白(NRBP)的基因，NRBP 参与调节细胞的信号传导通路及亚细胞内的运输10-11 ，据 Chua 等12报道，NRBP 与登革热病毒的 NS3 蛋白相互作用而参与登革热病毒的致病过程. 还有 5 个和已知基因 100%同源的 cDNA 片段功能未知；另有 5 个 cDNA 片段和已知基因同源性为50%84%，可能代表新基因，我们正在进一步验证. 我们研究结果表明这些基因可能在 HB
16、V 感染胎肝细胞的过程中构成一个相互作用的网络系统，但是他们的具体作用机制，仍需大量的实验证实，这也是我们今后要做的重点工作之一. 【参考文献】 1 王方, 王宇明, 汤勃, 等. 纤维结合素对 HBV 感染原代培养人胎肝细胞的影响J. 解放军医学杂志, 2004, 29（5）: 400-402. 2 王方, 王宇明, 汤勃,等. HBV 体外感染培养人胎肝细胞的鉴定方法比较J. 第三军医大学学报, 2004, 26（1）: 74-77. 3 Ohto H, Lin HH, Kawana T, et al. Intrauterine transmission of hepatitis B vi
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