1、PCR-SSP 法基因定型解决临床配血中血型问题赵志弘 何路军 乔芳 田亚娟 王振雷 张虹 刘敬闪【摘要】 目的利用 ABO 基因定型技术解决临床疑难血型定型 1 例。方法运用血型血清学方法、PCR-SSP(Sequence Specific Primer,SSP)基因定型法对比进行 1 例正反定型不符标本的检测。结果血清学方法不能正确定型。PCR-SSP 法基因定型结果是该患者为 O1O1V 基因型。结论血型基因定型技术较血型血清学方法更准确、可靠，是血型血清学技术的极好补充。 【关键词】 PCR-SSP;血型血清学;正反定型不符;ABO 基因定型;冷凝集素近些年来，随着城市人口的激增，血站
2、不仅在采供血量上增长很快，而且在实际工作中出现了更多的正反定型不符合标本，这些标本有来自血站内部检验科的，也有来自医院临床的。传统的血清学检测方法由于其自身局限性，因此面临很大挑战。笔者在实际工作中运用 ABO基因定型方法解决了一些疑难血型定型的常见问题，现以 1 例临床配血中出现的正反定型不符标本的鉴定报告如下。1 材料与方法1.1 血型血清学试验按照文献1操作。抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗球蛋白试剂、标准试剂 ABO 红细胞、谱细胞均由上海血液生物医药有限责任公司制备。1.2 血型基因定型 PCR-SSP; 血型血清学; 正反定型不符; ABO 基因定型;
3、冷凝集素采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术。DNA 提取严格按照 TIANGEN 血液基因组 DNA 提取试剂盒说明书进行。引物为采用瑞典隆德 Martin.L.Olsson 研究小组24与笔者自行设计，内对照为扩增人类生长激素基因(HGH),均由上海生工合成。PCR 扩增仪为美国ABI 公司 9700。引物混合物检测的基因特异性、突变位点和 PCR 产物片段大小见表 1。引物序列见表 2。1.2.1PCR 反应体系总反应体系 10l,引物浓度 10pmol/l,dNTPs浓度 10pmol/l,基因组 DNA 浓度 50ng/l,15mM MgCl2 (SIGMA 公司)
4、,内对照引物浓度 5pmol/l,5U/l Taq DNA 聚合酶(Promega,Shanghai)，甘油和甲酚红终浓度分别为 5%和 0.01% (SIGMA 公司)。表 1 基因分型引物检测的基因特异性、突变位点和 PCR 产物片段大小1.2.2PCR 循环参数采用热启动 DNA 变性技术 96预置 7min,然后按 94 30s,66 30s,72 1min 进行 32 个循环，再 72延伸 2min。1.2.3 电泳 PCR 产物用 2%琼脂糖凝胶电泳鉴别，电压 153V,时间15min，DNA Marker DL2000 为 TRAASTM 公司产品，凝胶成像仪拍照观察结果(见图
5、1)。2 结果患者,女,25 岁，2011 年 2 月患贫血入住省二院。医院在配血中发现其血型正反定型不符,遂请求本中心配型科鉴定。血清学鉴定结果及基因定型结果分别见表 3 和图 1。表 3 患者血清学结果图 1 表 3 显示：该患者正定型为 AB 型，反定型为 O 型。存在正反定型不符合现象。 图 1 显示：只有 1、4 泳道扩增出了特异性条带，1、4 泳道分别为 O1 和 O1V 基因的扩增产物，因此该患者基因型为 O1O1V。3 讨论患者血型血清学结果正反定型不符，正定型为 AB 型，反定型为 O型。因反定型 O 细胞、自身细胞凝集，提示该献血员血清中存在冷凝集素。37水浴后，正定型抗
6、A、抗 B、抗 A1、抗 AB 和反定型 O 细胞、自身细胞凝集消失，证明该患者血清中存在冷凝集素抗体。至此，定型不符的原因找到。基因定型图谱显示出了其 O1O1V 基因型：1、4 泳道为 O1和 O1V 基因，2、3 泳道为 A 基因，3、5、6 泳道为 B 基因。患者样本只在 1、4 泳道扩增出了特异性条带。综上所述，此类标本在血站或医院血库的日常工作中会经常遇到，具有较典型的代表性。此套常规 ABO 基因定型方法，切合实际，在 3h 内可完成从 DNA 抽提到基因扩增的完成，效率较高，相对血型血清学方法，能在较短时间内准确解决疑难血型标本的定型问题。此 PCR-SSP 法较PCR-RFL
7、P 法3(限制性内切酶法)具有省时、简便的特点。虽然血清学凝集反应是鉴定血型的基本方法，但是有其局限性，而以 DNA 为检材的基因分型技术，不受血型抗体来源以及生物活性细胞的限制。采用高通量基因分型平台可以检测血型基因变异体。当今，经典免疫血液学和分子免疫血液学很自然地整合在一起，形成了“后基因组时代免疫血液学” 。在整合的前提下，血清学方法和基因分型方法取长补短，相互补充，不存在谁取代谁的问题。从提高输血安全性方面考虑，向临床提供基因分型的血液制品，从供受者表型匹配逐步升级到基因型匹配，是今后的发展方向。血清学技术相对比较普及，当前加强分子生物学教育显得刻不容缓5。基因定型技术作为血型血清学
8、方法的极好补充，应当为广大血型工作者所熟知和掌握。【参考文献】1 肖星甫 输血技术手册 成都：四川科学技术出版社，1992：494-5142Olsson ML,Chester MA.Frequent occurrence of a variant O1 allele at the blood group ABO locus.Vox Sang，1996,70:26-303 刘长利，龚晓燕，王卓妍，等 北京地区汉族人群 ABO 血型基因分型研究 中国实验血液学杂志,2008，16(2):425-4284Okeefe DS,Dobrovic A.A rapid and reliable PCR method of genotyping the ABO blood group : A2 and O2 alleles .Human mutation,1996,8:3585 赵桐茂 后基因组时代的免疫血液学 中国输血杂志，2010，23(10):848-849
