1、RTPCR 分析肉芽组织生长过程中 VEGF 及3 整合素 mRNA 的表达作者：张聚良 王岭 晋援朝 黄庆生 金卫林 【关键词】 逆转录-PCR 关键词: 逆转录-PCR;新生血管化，病理性;内皮生长因子;结合素类 摘 要:目的 观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及 3 整合素 mRNA在肉芽组织血管生成中表达的动态变化. 方法 采用 RT-PCR法定量分析人正常皮下组织、增殖期肉芽组织（伤后 712d）及成熟期肉芽组织（伤后 3035d）VEGF 及 3整合素 mRNA的水平. 结果 在正常皮下组织中，VEGF 及 3 整
2、合素mRNA呈低表达，而在增殖期肉芽组织中表达升高，待肉芽组织完全成熟后二者的表达又有所降低. 结论 VEGF及 3 整合素 mRNA的水平与肉芽组织的血管生长过程呈动态相关，提示两种蛋白质可能在肉芽组织血管生成中发挥调节作用. Keywords:reverse transcription PCR;neovascularization，pathologic;endothelial growth factors;integrins Abstract:AIM To observe the dynamic changes in the ex-pression of vascular endothel
3、ial growth factor（VEGF）and integrin3mRNA during the angiogenetic process of granula-tion tissue.METHODS VEGF and integrin3mRNA inhuman normal subcutaneous tissue，proliferative granulation tissue（712days post-injured）and mature granulation tis-sue（3035days post-injured）were quantitatively analyzed wi
4、th RT-PCR.RESULTS In normal subcutaneous tissue，VEGF and integrin3mRNA were expressed low while in proliferative granulation tissue they were up-regulated.When granulation tissue was mature completely，the expres-sion of VEGF and integrin3declined again.CONCLUSION The levels of VEGF and integrin3mRNA
5、 are related to the growth of vessels in granulation tissue，which suggests that these two proteins may play an important role in regulat-ing the angiogenetic process of granulation tissue. 0 引言 血管生成指在已有血管床基础上长出新的毛细血管的过程，包括血管内皮细胞的激活，细胞外基质的降解，内皮细胞的增殖、移行，管腔结构形成及血管外膜的形成，然而迄今为止确切的机制尚不清楚.已有研究表明，许多病理过程如肿瘤的
6、生长及转移、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎等，都与血管生成密切相关1 .生理状态下，血管生成仅存在于胚胎发育、创伤愈合及女性生殖周期中，与病理性血管生成不同，这些过程中血管的生长受到严格调控，包括了增殖、成熟、退化三个阶段，反映了血管生成的全过程.然而，对这些过程中血管生成的研究却很少.生长因子和粘附分子作为血管生成的重要调节分子，越来越受到人们的重视，其中血管内皮生长因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）和 3 整合素是近年研究的热点.本实验旨在观察肉芽组织生长过程中 VEGF及 3 整合素 mRNA的表达，揭示它们与生理性血管生成的关系.
7、 1 材料和方法 1.1 材料 肉芽组织标本均取自我院门诊换药室患者，4 例为皮肤撕脱伤，1 例为狗咬伤，患者年龄 2030 岁，排除糖尿病等影响伤口愈合的疾患，分别于伤后 712d 和 3035d 取创面组织.正常皮下组织取自我院手术患者. 1.2 试剂及仪器 异硫氰酸胍、Sarcosyl，AMV 逆转录酶、Taq 酶、dNTP，RNAsin 分别购自原平生物公司和 Promga公司;DNA THERMAL CYCLER480，美国 PE公司;GDS 凝胶成像系统，美国 UVP公司. 1.3 RTPCR 1.3.1 引物设计 按文献报道2，3 ，VEGF 上游引物序列:5-GCACCCATG
8、GCAGAAGGAGGAG-3，下游引物序列:5-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3，PCR 产物为 567bp，495bp 和 363bp，3 整合素上游引物序列:5-GTGCT-GACGCTAACTGACC-3 ，下游引物序列:5-CATGGTAGTGGAGGCAGAGT-3，PCR 产物为 285bp. 1.3.2 总 RNA提取及定量 所取组织用 Chom-czynski改良一步法提取总 RNA，通过测定 A260 值计算 RNA浓度，A260 /A280 判定纯度. 1.3.3 RT-PCR反应 各组织总 RNA均取 1g（10L） ，加25molL-1 逆转录引物（下游引
9、物）1L，7010min 后立刻冰浴，加入下列成分:DW5L，5x RT缓冲液 5L，10mmolL-1 dNTP各 1L，RNasin0.5L（25U） ，AMV1L（5U） ，42逆转录1h，945min，冰浴 5min.各取 RT产物 10L，进行 PCR扩增，反应条件同于常规 PCR，循环温度为:941min，551min，722min，循环数分别采用 15，20，25 和 30，根据结果选择合适循环数，避免 PCR反应平台期，最终确定为 25个循环，0.2gL-1 琼脂糖凝胶观察结果. 1.3.4 荧光分析 琼脂糖凝胶电泳结束后，在 UVP凝胶成像系统上摄像，并用相应软件通过对条带大
10、小及深浅的差别分别对不同组织 RT-PCR扩增产物进行定量分析，结果采用完全随机化设计资料均数的 t检验进行统计分析. 2 结果 VEGF 有多种不同的 mRNA拼接产物，本实验选用引物可扩增出VEGF121 （363bp） ，VEGF165 （495bp）和 VEGF189 （567bp）3 种形式.电泳结果表明，VEGF 可见 3条扩增带，大小同预期设计一致（Fig1）3整合素 PCR产物为 265bp，电泳显示 300bp附近可见明显扩增带，与预期一致（Fig2）由电泳结果可以看出，正常皮下组织中 VEGF及 3 整合素mR-NA水平极低，在增殖期肉芽组织中表达明显升高，在成熟期肉芽组织
11、中表达又降低，而且，在 VEGF的 3种不同拼接产物中，VEGF165 表达最高. 图像分析定量的结果表明，在增殖期肉芽组织中，VEGF 及 3 整合素 mRNA水平高于成熟期肉芽组织（P0.05）及正常皮下组织（P0.01，Tab1）. 图 1 图 2 略 3 讨论 VEGF 是近年发现的可以特异性作用于血管内皮细胞（EC）的生长因子.体外实验证明 VEGF可以直接促进 EC的增殖，还可以通过提高已有血管的通透性，使血浆蛋白渗入基质，利于 EC的移行，间接促进血管生成4 .3 整合素属粘附分子家族成员，可与 IIb 或 V 亚基结合，其中 V3 分子在血管生成中的作用备受关注，表达于细胞膜表
12、面，识别细胞外基质的 RGD序列，对于 EC的移行有重要意义5 .本实验表明，正常皮下组织中没有血管生成的存在，VEGF 及 3 整合素 mRNA的表达很低;在肉芽组织增殖期，HE 切片证明 EC在局部聚集成团，胞质增多，增殖明显，增殖的 EC借助与细胞外基质的结合移行形成大量新生血管芽，此时 VEGF及 3 整合素水平明显增高，待肉芽组织完全成熟后，新生血管逐渐成熟退化，二者的表达也随之下降，表明 VEGF及 3 整合素可能是血管生成重要的始动分子，对于维持血管生成也有重要作用;同时也提示它们可以作为临床血管生成治疗的“靶分子”.VEGF 及 3 整合素受控表达的机制尚不清楚，缺氧及某些炎症
13、因子可能参与其中的调节6，7 . 表 1 不同组织中 VEGF及 3 整合素 mRNA表达水平的定量分析结果 略 RT-PCR 适于用 Northern blot检测不到的低丰度 RNA.实验证明，同一循环体系下，模板量在一定浓度范围内时，PCR 产物条带强度与模板量成比例关系;当循环次数处于 PCR扩增的对数增长期时，PCR 产物的荧光强度同模板量亦成比例关系8 ，因此用 RT-PCR定量分析 mRNA的关键是严格优化实验条件，如模板量及循环次数的控制等，本实验重复几次结果一致. 参考文献: 1Folkman J.Angiogenesis in cancer，vascular，rheumat
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