1、shRNA 抑制 COX2 基因表达对肝癌细胞HepG2 生长的影响作者：杨义明 刘预 涂植光 陈亚芹 刘靳波 【摘要】 目的： 应用 RNA 干扰技术抑制 COX2 基因，观察其对肝癌细胞 HepG2 生长的影响. 方法： 构建靶向抑制 COX2 基因表达的短发夹双链 RNA(shRNA)真核表达载 pshRNACOX2 ，转染肝癌细胞HepG2，用 RTPCR 和 Western Blot 分别从 mRNA 和蛋白水平检测其对COX2 的抑制效应，MTT 法检测对 HepG2 细胞生长的影响. 结果： 与未转染组相比，pshRNACOX2 重组表达质粒抑制了 HepG2 细胞 COX2 m
2、RNA 及蛋白表达，抑制率分别为 69.9和 50.3；并可抑制 HepG2 细胞生长，72 h 后有统计学差异(P0.05). 结论： pshRNACOX2 重组表达载体能显著抑制肝癌细胞 COX2 基因表达，从而抑制肿瘤细胞增殖. 【关键词】 RNA 干扰；重组表达载体；环氧化酶2 ；肝肿瘤 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of inhibition of cyclooxygenase2 （COX2 ） with RNA interference (RNAi) on the growth of hepatocellular carcin
3、oma HepG2 cells. METHODS: The eukaryotic expression plasmid of short hairpin RNA (shRNA) targeting COX2 gene (pshRNACOX2) was constructed and transfected into hepatocellular carcinoma HepG2 cells; the expressions of COX2 mRNA and protein were detected with reverse transcriptional polymerase chain re
4、action (RTPCR)and Western Blot assay, respectively. The growth of HepG2 cells was detected by MTT. RESULTS: Compared with untransfected group, recombinant expression vector pshRNACOX2 resulted in the reduction of COX2 mRNA and protein by 69.9% and 50.3% respectively, and the growth of HepG2 cells wa
5、s significantly inhibited after 72 h (P0.05) . CONCLUSION: Recombinant expression vector pshRNACOX2 can significantly inhibit the expression of COX2 gene , and suppress the growth of tumor cells. 【Keywords】 RNA interference; recombinant expression vcectors; cyclooxygenase2; liver neoplasms 0 引言 环氧化酶
6、（cyclooxygenase, COX）是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶，包括 COX1 和 COX2 两种同工异构体. 近年来研究表明，许多肿瘤，如结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌等 COX2 呈高表达状态，并在肿瘤的发生、发展及转移中起重要的作用1-6. 研究表明选择性 COX2 抑制剂可以抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞调亡，而成为肿瘤基因治疗的靶点. 我们采用 RNA 干扰(RNAi)技术抑制COX2 基因表达，观察对肝癌细胞生长的影响，为利用 RNA 干扰技术作为肿瘤基因治疗途径提供实验依据. 1 材料和方法 1.1 材料 真核表达质粒 pGenesil1 购于武汉晶赛公司，
7、含有人鼠人共用 U6启动子和编码绿色荧光蛋白的报告基因. COX2 靶基因序列：AACATGGAATTACCCAGTTTG .shRNA 转录 DNA 模板：正向链为 5GATCCC ATGGAATTACCCAGTTTGTTCAAGAGACAAACTGGGTAATTCCATGTTTTTGT CGAA3, 反向链为 5AGCTTGTCGACAAAAACATGGAA TTACCCAGTTTGTCTCTTGAACAAACTGGGT AATTCCATG G3 ， 以上片段由上海生工公司合成. 经 Blast 与现有人类基因无同源性的序列：5GACTTCATAAGGCGCATGC3 作为阴性对照，称为
8、HK（武汉晶赛合成）. 肝癌细胞株 HepG2,大肠杆菌 JM109 由本实验室保存. RPMI1640（Hyclone） ，新生小牛血清（杭州四季青公司产品） ，阳离子脂质体转染试剂 LipofectamineTM 2000(Invitrogen)，Hind, BamH, RTPCR 试剂（大连宝生物公司产品） ，COX2 一抗（Santa Cruz 产品） ，COX2 二抗, DAB 显色试剂（北京中杉公司产品） . 肝癌细胞株 HepG2用含 100 mL/L 小牛血清的 RPMI 1640 培养基于 37，50 mL/L CO2 培养箱常规培养，待细胞铺满瓶底 80左右时传代. 1.2
9、 方法 将合成的单链 DNA 片段用退火缓冲液稀释，等摩尔混合. 94 5min，缓慢降至室温形成互补双链. Hind，BamH双酶切质粒pGenesil1 ，凝胶回收大片段线性 DNA，T4 连接酶 4过夜连接，转化感受态大肠杆菌 JM109, 铺含卡那霉素的 LB 抗性板培养 16 h，挑取菌落,增菌, 提取质粒, 酶切鉴定并测序确认. 实验分为 3 组：未转染细胞HepG2 组，pshRNACOX2 组，阴性对照 HK 组. 用 2.5 g/L 的胰酶常规消化对数期生长的细胞，稀释成 1108 /L, 每孔 2 mL，接种于六孔培养板，待细胞铺满 80左右时转染. 首先用无血清无双抗 R
10、PMI 1640 培养基洗涤 2 遍. 质粒 4 g，加无血清无双抗 RPMI 1640 培养基250 L，脂质体 10 L，加无血清无双抗 RPMI 1640 培养基 250 L，静置 5 min,将二者轻轻混匀，静置 20 min，加六孔入培养板常规培养， 46 h 换生长培养液，24 h 转种培养瓶. G418 筛选： 初始终浓度 800 mg/L, 4 d 左右大部分未转染细胞将被处死，维持终浓度 400 mg/L，23 wk 收集细胞，供 RTPCR 和 Western Blot 分析. 1.2.1 肿瘤细胞中 COX2 mRNA 和蛋白的检测常规胰酶消化收集细胞，冷 PBS 洗涤
11、2 遍，按试剂盒说明书提取细胞总 RNA,逆转录成 cDNA . PCR：COX2 引物序列：P1：5TTCAAATGAGAT TGT GGG AAA AT3, P2: 5AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT3, 扩增片段长度 304 bp. 内参 actin 引物序列：P1：5GGG ACC TGA CTG ACT ACC TC3 P2： 5CGT CAT ACT CCT GCT TCC TG3 ，扩增片段长度 543 bp. PCR 循环：94 40 s, 55 30 s, 72 50 s, 38 个循环. Western Blot 主要步骤：用 RIPA（含 P
12、MSF 蛋白酶抑制剂）细胞裂解液提取总蛋白，蛋白变性上样，行 100 g/L 十二烷基硫酸钠聚丙烯胺凝胶电泳，转 NC 膜，用 50 g/L 脱脂奶粉的 TBST 封闭 2 h,加 COX2 多抗（1200） ，4过夜，TBST 洗涤 3 次（10 min/次） ，二抗（15000）室温 2 h，洗涤 3 次，每次 10 min，DAB 显色. 数码照相. 1.2.2MTT 实验检测细胞生长情况用 2.5 g/L 胰酶将对数期生长细胞消化下来，稀释成 1108 个/L，转种 96 孔板，每孔 200 L，置于37, 50 mL/L CO2 培养箱培养，分别于 24, 48, 72, 96, 1
13、68 h 时，每孔加终浓度为 5 g/L MTT 200 L，继续培养 3 h，终止反应. 弃去上清液，加 DMSO 200 L/孔，充分振荡 10 min，酶标仪（波长 570 nm）测定吸光度 A 值. 每组 3 个复孔，取其平均吸光度 A 值，比较个组细胞生长情况. 统计学分析：RTPCR 和 Western Blot 结果用 Quantity one 软件分析灰度值，计算抑制率. MTT 结果采用均数标准差表示，组间均数比较用单因素方差分析，P0.05 为有统计学意义. 2 结果 2.1psRNACOX2 重组质粒测序和转染挑取卡那霉素抗性板上生长的菌落，增菌并提取质粒，Hind, B
14、amH双酶切切出 400 bp 左右的DNA 片断，经测序插入片断序列正确（图 1）. pshRNACOX2 重组质粒转染 48 h 时，转染率为 50%左右（图 2）. 2.2 shRNACOX2 重组质粒对 COX2 表达的影响与未转染细胞相比，pshRNACOX2 重组质粒对 actin 无抑制作用，而对靶基因COX2 mRNA 有明显的抑制作用，抑制率为 69.9，未转染细胞与阴性对照之间没有差异（图 3A）. 与未转染细胞与未转染细胞相比，actin 及阴性对照 HK 几乎无变化，而转染 pshRNACOX2 质粒的细胞 COX2 蛋白表达水平明显下降，抑制率为 50.3（图 3 B
15、）. 2.3pshRNACOX2 重组质粒转染对细胞增值的影响与未转染细胞相比，pshRNACOX2 重组质粒转染后，24, 48 h 时吸光度 A 值变化不明显，而 72 h 后吸光度 A 值明显下降. 说明 72 h 后细胞增殖开始得到抑制. 转染阴性对照质粒 HK 的细胞与未进行转染的 HepG2 细胞相比，转染后 24, 48, 72, 96, 168 h 细胞生长和增殖均未受到影响（图 4）. 3 讨论 RNA 干扰（RNA interference, RNAi）是通过双链 RNA 介导同源性mRNA 的特异性降解，导致转录后基因沉默，作为一种高效、特异的基因调节技术，目前已经成为研
16、究基因功能的有力工具. RNAi 现象的发现也为肿瘤的基因治疗提供了新的方法. 利用 RNAi 技术抑制 hTERT, Survivin 的表达，可以起到抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞调亡，达到治疗肿瘤的目的7-8 ，显示出 RNAi 技术在肿瘤基因治疗中的巨大潜力. 小干扰 RNA（small interfering RNA, siRNA）可在哺乳细胞中诱导特异性基因沉默. siRNA 可通过化学合成、体外转录或核酸内切酶降解等途径合成，但化学合成成本昂贵，内切酶可导致非特异性效应，且有 siRNA 瞬时转染介导的沉默效应持续时间短的缺点. 如果将转录siRNA 的 DNA 模板克隆至 RN
17、A 聚合酶 III 的下游，可在细胞内持续转录产生小 RNA 分子，通过自身折叠形成发夹样（hairpin）结构，即内源性 siRNA,可与靶基因结合降解 mRNA，实现靶基因的持续抑制 ，可克服上述缺点. 我们将靶向抑制 COX2 基因的 siRNA 的 DNA 转录模板插入到质粒 pGenesil2 的 U6 启动子下游，转录的 mRNA 通过自身折叠形成发夹样结构（shRNA）,经 Dicer 酶切割形成 siRNA,供探讨其对靶基因COX2 抑制效应. 我们构建的靶向抑制 COX2 基因的重组表达质粒转染肝癌细胞 HepG2 后 COX2 基因及蛋白显著下调，抑制率分别为 69.9和
18、50.3，而对内参基因 actin 没有影响，提示利用 RNAi 技术抑制COX2 基因表达是切实可行的. MTT 实验显示，pshRNACOX2 重组质粒转染 HepG2 细胞 72 h 后，细胞增殖明显减慢，与未转染细胞组相比有显著性差异（P0.05） ，并可持续至少 1 wk. 本研究表明，利用RNAi 技术可抑制 COX2 表达，进而抑制肿瘤细胞增殖，为高表达COX2 基因的恶性肿瘤基因治疗新途径提供了实验依据. 基金项目：重庆市自然科学基金项目（2006BB5271） 【参考文献】 1Singh B, Berry JA, Shoher A, et al. COX2 overexpre
19、ssion increases motility and invasion of breast cancer cells J. Int J Oncol, 2005,26(5):1393-1399. 2郭贵龙 ，姚榛祥，吴坚 . 环氧化酶2 基因在人乳腺癌中的表达及临床意义J.中华医学杂志,2003，83（19）：1661-1664. 3Lu S, Yu G, Zhu Y ,et al .Cyclooxygenase2 overexpression in MCF10F human breast epithelial cells inhibits proliferation ,apoptosis
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