1、白细胞介素 18、血管内皮生长因子-C 及其受体 3 在大肠癌中的表达和在淋巴结转移中的意义作者：陈昊 白玲 张昶 刘毅 孟健 【摘要】 目的 探讨白细胞介素 18（IL-18） 、血管内皮生长因子-C（VEGF-C）及其受体 3（VEGFR-3）在大肠癌中的表达意义及与淋巴结转移的关系。方法 应用免疫组化 MaxVision 快捷二步法检测 30 例大肠癌组织中 IL-18、VEGF-C、VEGFR-3 表达情况，并以 10 例正常黏膜和 10 例淋巴结转移性大肠癌组织标本做对照。结果 IL-18、VEGF-C、VEGFR-3 在大肠癌组织中的表达均明显高于正常黏膜（P0.05） ；IL-1
2、8 及 VEGF-C在淋巴结转移性大肠癌组织中的表达也高于正常黏膜，且 IL-18 与 VEGF-C 的表达呈正相关（P0.05） ；VEGF-C 在淋巴结有转移组的表达明显高于淋巴结无转移组（P0.05） 。结论 大肠癌细胞可表达 IL-18、VEGF-C、VEGFR-3，其表达与大肠癌的发生、发展有关；VEGF-C 表达与大肠癌淋巴结转移显著相关，可作为判断患者淋巴结转移的重要指标。 【关键词】 大肠癌；血管内皮生长因子-C；血管内皮生长因子受体 3；白细胞介素 18；淋巴结转移性大肠癌 Abstract： Objective To investigate the expressions
3、of IL-18, VEGF-C and VEGFR-3 in human colorectal cancer and their significance in lymphatic metastasis. Methods Immunohistochemical MaxVision method was used to detect the expression of IL-18, VEGF-C and VEGFR-3 in 30 specimens of colorectal cancinoma, 10 normal mucosa and 10 lymph node with metasta
4、tic cancer. Results The expressions of IL-18, VEGF-C and VEGFR-3 in colorectal carcinoma were significantly higher than that in normal mucosa (P0.05). IL-18 and VEGF-C were higher in metastatic lymph nodes than in normal mucosa, with the two expressions positively correlated (P0.05). The expression
5、of VEGF-C was higher in the lymph node with metastatic cancer than in that without (P0.05). Conclusion Colorectal carcinoma cells can express IL-18, VEGF-C and its receptor VEGFR-3, their higher expressions are correlated with the carcinogenesis and development of colorectal carcinoma. The higher ex
6、pression of VEGF-C is closely correlated with lymphatic involvement, and thus could be used as an important predictive marker for lymphatic metastasis. Key words: colorectal neoplasm; interleukin 18; vascular endothelial growth factor-C; vascular endothelial growth factor receptor 3; lymph node; met
7、astasis 淋巴道转移是大肠癌进展的重要因素。淋巴管生成（lymphangiogenesis）作为淋巴道转移的分子机制，近年来越来越受到重视。新近研究表明，血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C）可通过 VEGF-C/VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3)信号通路1介导淋巴管内皮细胞增殖，调节淋巴管内皮细胞分化和淋巴管增生促进肿瘤淋巴道转移，被称为淋巴管生成因子；白细胞介素 18(interleukin-18, IL-18)是新近发现主要由巨噬细胞和
8、树突状细胞分泌的细胞因子，可通过不同的信号转导途径起效，具有抗感染、抗肿瘤、介导炎症反应、诱导靶细胞凋亡等多种生物学活性2 。IL-18 对淋巴管生成的作用，尚未见报道。我们采用免疫组化 MaxVision 快捷二步法检测大肠癌组织中 IL-18、VEGF-C（VEGFAb-3）和 VEGFR-3 (fms-like tyrosine kinase -4, Flt-4)的表达变化规律，并以正常大肠黏膜和淋巴结转移大肠癌组织对照，探讨其表达意义及与淋巴道转移之间的关系，旨在为大肠癌的分子靶向治疗提供科学依据。 1 材料和方法 1.1 材料 111 研究对象 选取我院外科 2003 年2007 年
9、间手术切除大肠癌组织标本 30 例，术前未经过任何放射或化学治疗。患者年龄 3081岁，平均（59.2314.77）岁，男 23 例、女 7 例。另选正常大肠黏膜 10例和 10 例转移性大肠癌淋巴结组织为对照。 112 试剂 兔抗人 IL-18 浓缩型抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，VEGFAb-3 及 Flt-4 为 LabVision-NeoMarkers 公司产品，即用型快捷免疫组化 MaxVisionTM 试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。 1.2 方法 121 免疫组化 MaxVision 检测方法 5 m 石蜡切片脱蜡和水化后；用 PBS（pH 7.4）冲洗 3 次；
10、高压锅热修复；每张切片加 3%的过氧化氢 1 滴，室温孵育 10 min；用 PBS 冲洗 3 次；每张切片分别加 1 滴抗体稀释度为 1100 的 IL-18、VEGFAb-3 或 Flt-4；4过夜；用 PBS 冲洗 3 次；每张切片加 1 滴即用型 MaxVision 试剂，室温孵育 1015 min；用 PBS（pH 7.4）冲洗 3 次；每张切片加 2 滴新鲜配制的 DAB 溶液，显微镜下观察控制显色时间；终止显色后，自来水冲洗，苏木精复染；自来水冲洗返蓝，经梯度乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树胶封固。PBS 代替一抗做阴性对照。 122 结果判定标准 显微镜下观察细胞，在胞质出现定
11、位明确、染色明显的棕黄色颗粒为阳性细胞。按阳性细胞比例，组织蛋白表达强度分为以下几级：无细胞着色为（-） ；阳性细胞数25%为（+） ；阳性细胞数在 25%50%为（+） ；阳性细胞数50%为（+） 。组织染色（+）（+）者定为高表达组， （+）者定为低表达组,（-）为阴性。 13 统计学处理 使用 SPSS 10.0 软件统计分析，计数资料的比较采用 2 检验之 Fisher 确切概率法；相关性用 Pearson 相关分析；P0.05 为差异具有统计学意义。 2 结 果 21 IL-18、VEGF-C、VEGFR3 的表达情况 211 IL-18 表达情况 IL-18 阳性颗粒主要定位于细胞
12、质（图1） ，正常大肠黏膜组织的阳性表达率为 40%（4/10） ，4 例均为低表达，占 100%；大肠癌组织中的阳性表达率为 96.67%（29/30） ，低表达占30%，高表达占 70%；淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性率为100%（10/10） ，低表达占 40%，高表达占 60%。IL-18 在大肠癌组织及淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性表达率差异无统计学意义（2=0.333, P=1.000） ，并以高表达为主；但均高于正常黏膜，且有统计学意义（2=16.264, P=0.000; 2=8.143, P=0.011） 。 图 1 IL-18 在大肠癌组织的阳性表达 （免疫组化，200）
13、212 VEGF-C 表达情况 VEGF-C 阳性颗粒主要定位于细胞质（图 2） 。正常大肠黏膜组织的阳性表达率为 30%（3/10） ，3 例均为低表达，占 100%；大肠癌组织中的阳性表达率为 80%（24/30） ，低表达组占40%，高表达占 60%；淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性率为100%（10/10） ，均为低表达。VEGF-C 在大肠癌组织及淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性表达率差异无统计学意义（2=2.294, P=0.307） ，在大肠癌组以高表达为主，在后者全部低表达；但两者均高于正常黏膜，且有统计学意义（2=8.333, P=0.006；2=10.231, P=0.003）
14、 。 213 VEGFR-3 的表达情况 VEGFR-3 阳性颗粒定位于细胞质（图 3） 。正常大肠黏膜组织的阳性表达率为 30%（3/10） ，3 例均为低表达，占 100%；大肠癌组织中的阳性表达率为 96.67%（29/30） ，低表达占10%，高表达占 90%；淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性率为 60%（6/10） ，低表达占 100%。VEGFR-3 在大肠癌组织中的阳性表达率高于淋巴结转移性大肠癌组织和正常黏膜，且有统计学意义（2=8.989， P=0.010；2=20.312，P=0.000） ；淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性表达率与正常黏膜差异无统计学意义（2=1.727，P=
15、0.370） 。 图 2 VEGF-C 在大肠癌组织的阳性表达 （免疫组化，200） 图 3 VEGFR-3 在大肠癌组织的阳性表达 （免疫组化，200） 22 IL-18、VEGF-C 及 VEGFR3 在大肠癌组织表达与临床病理特征的关系 鉴于在大肠正常黏膜组织中观察到三者均有（+）的低表达，将与临床病理特征的关系用高表达组和低表达组进行统计分析，详见表 1。三者表达强度与性别、年龄、组织分化、组织类型、组织分期均无关（P0.05） 。IL-18、VEGFR3 在淋巴结转移组的表达强度虽高于无转移组，但无统计学意义（P0.05） 。VEGF-C 在淋巴结转移组的表达明显高于淋巴结无转移组，
16、且有统计学意义（2=5.438，P=0.024） 。 23 大肠癌组织中 IL-18、VEGF-C 及 VEGFR-3 三者之间表达的相互关系 在 21 例 IL-18 高表达组织中 VEGF-C 高表达 16 例、低表达 5 例；9 例 IL-18 低表达组织中其高表达 2 例，低表达 7 例；两者表达呈明显正相关（r=0.505，P=0.004） 。在 18 例 VEGF-C 高表达组织中 VEGFR-3 高表达 16 例，低表达 2 例；12 例 VEGF-C 低表达组织中其高表达 11 例，低表达 1 例；两者表达无明显相关（r=0.045，P=0.812） 。在 27 例 VEGFR
17、3 高表达组织中 IL-18 高表达 19 例、低表达 8 例；3 例 VEGFR-3 低表达组织中其高表达 2 例，低表达 1 例；两者表达无明显相关（r=0.024，P=0.899） 。表 1 大肠癌组织 IL-18、VEGF-C 和 VEGFR-3 表达与临床病理特征的关系（略 ）注：2 值为(-)和(+)与(+)比较,* P0.05 3 讨 论 肿瘤转移通常是人类癌症致死的主要原因，在肿瘤转移过程中血管内皮生长因子及其受体家族发挥了重要的作用。目前认为，VEGF 家族可通过 VEGF/VEGFR-1 途径诱导血管生成，VEGF-C/D 与 VEGFR-2 结合可诱导血管的生成，而通过
18、VEGFR-3 与 VEGF-C/D 结合途径诱导淋巴管生成3 。虽然 VEGF-C/D 在诱导淋巴管或血管生成中的选择性作用机制还不是十分明确，但阻断 VEGFR-3 信号通路可能是抑制肿瘤淋巴道转移的途径之一。本实验结果显示大肠癌组织中 VEGFR-3 的阳性率高于正常黏膜和淋巴结转移性大肠癌组织（P 0.05） ，且处于高表达状态；而 VEGF-C 在大肠癌组织和淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性表达率明显高于正常黏膜（P0.05） ；VEGFR-3 在淋巴结有转移组的表达强度虽高于无转移组，但差异无统计学意义（P0.05） 。VEGF-C 在淋巴结有转移组的表达明显高于淋巴结无转移组，且有
19、统计学意义（P0.05） 。表明 VEGFR-3 和VEGF-C 均参与了大肠癌的发生、发展，VEGF-C 在淋巴结转移中发挥了重要作用。提示阻断 VEGF-C/VEGFR-3 信号通路，可减缓大肠癌的发展；VEGF-C 可作为大肠癌淋巴道转移的预测因子。 众所周知，机体的免疫状态是导致肿瘤发生、发展的重要原因之一。IL-18 是新近发现的 -干扰素诱导因子,可通过不同的信号转导途径起效,并能抑制肿瘤血管的形成,从而发挥抗肿瘤的作用4 。另有研究报道，IL-18 在肿瘤免疫中有可能与 IL-2 发挥协同作用，诱导 NK 细胞和 T细胞产生 IL-13，促使 Th2 分化，从而影响机体细胞免疫状
20、态，导致肿瘤的扩散和转移5 ，在胃癌6 、结肠癌7患者术前血清中 IL-18 水平明显高于正常对照组。本实验结果显示，大肠癌组织和淋巴结转移性大肠癌组织中 IL-18 阳性表达率明显高于正常黏膜（P0.05） ，癌组织中有 70%的高表达，但与临床病理特征无关，与 VEGF-C 的表达呈明显正相关（P0.05） ；表明大肠癌时细胞中 IL-18 的表达升高，影响机体细胞免疫功能状态,参与大肠癌淋巴道转移，导致肿瘤进展。 本实验中 3 种蛋白均可观察到细胞核中有表达的现象,经与试剂公司沟通交流后,排除缓冲液 pH 值的影响，考虑可能为抗体稀释度较高的原因所致。 【参考文献】 1 Mandriot
21、a SJ, Jussila L, Jeltsch M, et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumor metastasis J. EMBO J, 2001,20(4):672-682. 2 Ushio S, Namba M, Okura T, et al. Cloning of the cDNA for human IFN- inducing factor, expression in Escherichia coli, and studies on the biolo
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