1、成人骨髓间充质干细胞对脐血 CD34+细胞的体外扩增作用作者：贾明峰,侯相麟,赵丽,刘蓓,李娟,陈轩 【关键词】 骨髓细胞 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of adult bone marrow mesenchymal stem cells on the expansion of umbilical cord blood CD34+ cells ex vivo. METHODS: Adult bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured as feeder la
2、yer. Umbilical cord blood CD34+ cells were cultured in combination with mesenchymal stem cells, stem cell factor, Interleukin11 and granulocytemacrophage colony stimulating factor, respectively. At the end of 3 weeks, the total number of nucleated cells , colony forming cells and CD34+ cells was rep
3、eatedly counted in culture system for 3 weeks to obtain the fold of expansion. RESULTS: The mesenchymal stem cells and cytokines coculture systems significantly enhanced the expansion of the cord blood cells with the increase of the total number of nucleated cells by 114.22.4fold, colony forming cel
4、ls by 40.58.6fold and CD34+ cells by 11.30.4fold, respectively. CONCLUSION: The expansion of umbilical cord blood CD34+ cells can be enhanced ex vivo by adult bone marrow mesenchymal stem cells combined with cytokines. 【Keywords】 ex vivo amplification; CD34+ cell; cord blood; bone cells; stem cells
5、【摘要】 目的： 探讨骨髓间充质干细胞(MSCS)对脐血 CD34+细胞体外扩增作用. 方法： 分离培养成人 MSCS作为滋养层，联合 SCF, IL11和 GMCSF分别组成对脐血 CD34+细胞的不同扩增体系，培养 3 wk后观察脐血有核细胞、CFCs 以及 CD34+细胞扩增倍数的变化. 结果： MSCS联合细胞因子组较其他组培养体系对有核细胞总数、CFCs 含量及 CD34+细胞含量均具有明显的扩增作用，分别扩增了 114.22.4, 40.58.6, 11.30.4 倍. 结论： 成人 MSCS协同其他细胞因子可增强脐血 CD34+细胞的体外扩增作用. 【关键词】 体外扩增；CD34
6、+细胞；脐血；骨髓细胞；干细胞 0 引言 骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作为骨髓造血微环境中的一种重要细胞成分,近年来成为干细胞研究领域的一大热点. MSCs具有自我更新和多向分化潜能，在体外可被诱导分化为多种结缔组织及部分来源于外胚层的组织，形成骨、软骨、骨骼肌、腱、韧带、真皮、脂肪、骨髓基质和神经1,2. 此外，还分泌多种生长因子支持骨髓造血，藉此 MSCs可在体外作为滋养细胞层进行造血干/祖细胞扩增. 自脐血（umbilical cord blood,UCB）中发现造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)以来，脐血
7、 HSC移植用于治疗恶性及非恶性血液病日益广泛，但单份脐血所含的造血细胞不足以满足成人的移植所需，大量扩增后才能用于移植. 鉴于此，我们探讨了来自成人的MSCS对脐血 CD34+ 细胞的体外扩增作用. 1 材料和方法 1.1 材料 正常成年男性献骨髓者 2例，健康足月分娩儿脐血 14例,取自兰州市慈和堂医院和本院妇产科. Percoll分离液（密度 1.073 kg/L),淋巴细胞分离液（密度 1.077 kg/L）,马血清（HS）均购自 TBD 公司；DMEMLG培养基购自 PAA Lab (Germany)；IMDM 购自 Gibco公司;胎牛血清(FBS)为杭州四季青公司产品;BSA、甲
8、基纤维素、 巯基乙醇及 L谷氨酰胺购自 Sigma公司；重组人干细胞因子（rhSCF） ，重组人白细胞介素11（rhIL11）, 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF） ，重组人粒细胞集落刺激因子（rhGCSF）,重组人红细胞生成素（rhEPO）均购自 Peprotech公司；荧光标记的抗 CD34单克隆抗体（CD34PE）购自Coulter Immunotech公司；抗 CD29, CD44, CD45和抗 HLADR单克隆抗体购自 PharMingen公司. 1.2 方法 1.2.1MSCs 的分离纯化及培养 MSCs的分离纯化及培养按文献3介绍的方法进行. 收集正常肝素抗凝骨
9、髓约 10 mL，用 Percoll溶液梯度离心,900 g 30 min,收集中间相为有核细胞,然后将细胞按 2108 /L密度接种于 DMEMLG培养基 (含 100 mL/L FBS, L谷氨酰胺，青霉素 105 u/L，庆大霉素 8104 u/L)的塑料培养瓶中，37, 50 mL/L CO2饱和湿度孵箱中培养,72h 后更换培养基,以后每 34 d换液一次. 当贴壁细胞达 90%以上融合时，用 2.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA消化后传代培养. 传代第 3代以后用于以下实验. 1.2.2MSCs 表面分子测定用 2.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA消化收获细胞,至少
10、 2105个细胞与抗 CD29, CD44, CD45, HLADR抗体室温反应 30 min， PBS洗涤 2次，后与 FITC标记的二抗避光反应 15 min. 细胞洗涤后悬浮于 PBS中，Coulter Epics XL 流式细胞仪分析相关数据. 1.2.3 脐血的采集、单个核细胞分离及 CD34+细胞含量测定收集正常足月新生儿脐血,4保存运输,于 4 h内用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（mononuclear cells, MNC）. 取 100 L MNC悬液上机检测 CD34+细胞含量，具体方法是： 取阴性对照（Mouse IgG1）与荧光标记的 CD34单抗（CD34PE）各 2
11、0 L 于试管底部，再分别加入 100 L 细胞悬液室温避光孵育 15 min，后用 QPrep(全血细胞制备仪)处理细胞，于测试管内加 100 L Flow Count（荧光微球） ，混匀后用流式细胞仪分析. 1.2.4 细胞扩增分组和脐血 MNC, CD34+细胞体外培养根据培养体系中有否滋养层及是否添加细胞因子组合分为以下 3组： A组为无滋养层加细胞因子，即 MNC+SCF+IL11+GMCSF；B 组为骨髓间充质干细胞滋养层无细胞因子，即 MNC+MSC；C 组为骨髓间充质干细胞滋养层加细胞因子，即 MNC+MSC+SCF+IL11+GMCSF. 脐血 MNC, CD34+细胞培养在
12、 24孔培养板中进行，培养体系为： IMDM中含 125 mL/L FBS, 125 mL/L马血清，各种人细胞生长因子（SCF 50 g/L, IL11 50 g/L, GMCSF 2 g/L）. 脐血 MNC, CD34+细胞与 MSC 共培养体系为： MNC按 1.01011/L 接种于铺满 MSCs滋养层的 24孔板中，每孔 1 mL, 33, 50 mL/L CO2和饱和湿度的培养箱中连续培养 3 wk. 每周半量换液，并计数有核细胞（nucleated cells, NC）总数、作集落培养及扩增细胞中 CD34+细胞含量测定. 1.2.5 造血祖细胞集落培养用甲基纤维素半固体集落培
13、养法测定扩增细胞集落形成能力，培养体系为： IMDM中含 300 mL/L HS, 10 g/L BSA, 2 mmol/L L谷氨酰胺 ,110-4 mol/L 巯基乙醇（2MP）, rhSCF 50 g/L, IL11 50 g/L, GMCSF 20 g/L, G CSF 20 g/L, EPO 3000 u/L和 9 g/L甲基纤维素. 培养在 24孔培养板中进行，37, 50 mL/L CO2和饱和湿度条件下连续培养 14 d. 每周在倒置显微镜下直接计数集落形成细胞（colonyforming cells, CFCs） ，40 个细胞为 1个集落. 统计学处理: 数据用 xs表示，
14、采用 SPSS8.0统计软件作重复测量资料的方差分析，P0.05 认为有统计学意义. 2 结果 2.1MSC 的形态学特征及表面抗原特性经 Percoll分离液分离后培养的骨髓单个核细胞，大部分于 24 h内即贴壁，倒置显微镜下，细胞呈圆形有小的胞质突起. 72 h后，大多数细胞有胞质突起. 1 wk后以梭形细胞为主，胞质丰富，核大，核染色质细，核仁明显. 以后随传代次数的增加，细胞扩增显著，呈成纤维细胞样形态，平行排列生长或似漩涡状. 流式细胞仪测定 F3代 MSC 表面分子显示，CD34, CD45, HLADR 等为阴性，CD29, CD44等为阳性，并且传代前后 MSC形态及表面标志一
15、致. 2.2 脐血中 MNC总数、CD34+细胞含量测定本组 14份标本中有核细胞含量个体差异较大，其中 MNC总数为（6.362.12）109/L参考值范围（2.2415.80）109/L，流式细胞仪检测的 CD34+细胞含量为（21.22.9）106/L参考值范围（13.730.2）106/L ，体积差异也较大，中位体积 55 mL（参考值范围 35120 mL）. 2.3MSC 对脐血 NC总数、CFCs 的扩增作用不同的扩增体系在体外连续观察 3 wk，结果显示：A 组到 C组 NC 总数均得到不同程度的扩增（Tab 1） ，其中 C组扩增最为明显，与最初所接种细胞相比，于培养第1,
16、2和 3周分别扩增 7.61.1, 41.51.3, 114.22.4倍，并且与 A组和 B组分别比较，有显著的统计学意义（P0.05）. 脐血中的CD34+细胞多为较早期的造血干/祖细胞，故 CFC的含量较低. 在 2 wk的体外培养过程中，各组 CFC产率不尽相同（P0.05） ，并且它们的扩增倍数在第 2周达到较高值（Tab 1） ，其中 C组扩增倍数达 40.58.6. 表 13组扩增体系对脐血 NC, CFCs扩增倍数（略） 2.4MSC 对脐血 CD34+细胞的扩增作用于培养的第 1, 2和 3周分别取脐血 MNC，用 PECD34单克隆抗体标记，流式细胞术荧光微球标记法检测其中
17、CD34+细胞的含量. 结果表明，不同组别 CD34+细胞总数均得到不同程度扩增，而 C组的扩增效果明显优于其他两组（P0.05） ，CD34+细胞于第 2周和第 3周分别扩增（11.30.4）倍和（6.11.1）倍（Fig 1）. 3 讨论 目前认为 MSC是基质细胞的前体细胞，参与构成骨髓造血微环境，其调节造血的机制是通过 MSC与造血干细胞的密切接触以及各类造血生长因子的作用完成的. Majumdar等4检测人 MSC的基因表达及不同诱导条件下 MSC细胞因子的表达水平变化及其对 HSC的支持作用发现，MSC 表达 IL11, LIF, MCSF及 SCF的 mRNA. 这些细胞因子都是
18、很重要的造血生长因子，它们是 MSC参与造血调控、支持造血的物质基础. 近年来脐带血 HSC移植的例数在逐年增加，但由于单份脐血所含造血细胞数量少，不能满足成人患者移植的需要，故许多研究者尝试通过各种体外扩增的方法提高脐血移植的细胞数. 本研究基于 MSC体外支持长期造血的特性，外加细胞因子观察了其对脐血 CD34+细胞的体外扩增作用. MSC经分离、培养和纯化三代后用作饲养层，根据是否加用 SCF, IL11和 GMCSF分为三组不同扩增体系培养 3 wk，结果各组对 NC, CFCs和 CD34+细胞均有不同程度的扩增. MSC加细胞因子组较 MSC 组和单纯细胞因子组的造血细胞总数和 C
19、FC明显增多，有核细胞总数扩增倍数最高可达(114.2 2.4)倍，CFC 扩增倍数第 2周达(40.58.6)倍. 在对 CD34+细胞扩增的动态观察中采用流式细胞仪 CD34+细胞绝对定量法，较为精确地测定了脐血有核细胞中 CD34+细胞含量在扩增前后的变化，各组 CD34+细胞总数在第 2周均达最高，其中以 MSC加细胞因子组对 CD34+细胞扩增作用最强，CD34+细胞总数在第 2周扩增(11.30.4)倍，明显高于其他两组（Fig 1）. 脐血 CD34+细胞于第 2周后含量下降，可能是向定向祖细胞发生了分化，但其绝对计数仍显著高于分离培养前. MSC体外扩增脐血造血干细胞关键是要建
20、立好滋养层. 实验中发现，MSC 最初 1 wk内生长缓慢，需10 d左右达 90%以上融合，此时传代后细胞生长迅速，5 d后即达 80%以上融合，到第 3代以后 MSC生长渐趋稳定，流式细胞仪检测显示不表达造血细胞的标志，故本实验选用了第 3代以后的 MSC. 随着基因工程的发展，各种重组造血生长因子广泛用于脐血造血干/祖细胞的体外扩增. SCF是原癌基因 ckit的配体，是一种作用于最早期造血干/祖细胞的造血生长因子，在维持造血细胞存活，促进造血细胞增殖分化，调控各系造血细胞的生长发育中起重要作用. SCF单独作用刺激造血细胞增殖和促进克隆形成的能力都很微弱，而与其他细胞因子有明显协同促进
21、造血功能等作用. IL11能与多种其他细胞因子协同支持造血细胞前体细胞长期生长，对淋巴系、髓系、红细胞系和巨核细胞系都具有促进生长作用，尤其对巨核细胞系作用明显，能显著增加血小板的数量5. GMCSF对粒细胞系和单核细胞系细胞均有促进生长、诱导分化的功能，并维持造血前体细胞和成熟细胞的存活. 以上三种细胞因子加上MSC滋养层构成了脐血 CD34+细胞扩增的强大物质基础，使脐血 CD34+细胞得到有效扩增. 我们选用流式细胞仪荧光微球标记法测定脐血 MNC中 CD34+细胞的含量，较以往测定 CD34+细胞的百分率更简便、精确，值得在临床造血干细胞移植中推广使用. 尽管脐带血干细胞移植已有十几年
22、的历史，研究者在脐血干细胞扩增方面做了大量的实验研究，但目前很少见到利用扩增的脐血造血干细胞临床移植成功的报道，这一课题仍需要作进一步的探讨. 【参考文献】 1 Deng W， Obrocka M， Fischer I， et al. In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP J. J Biochem Biophys Res Commun, 20
23、01;282:148-152. 2 Mingull JJ, Conget P, Erices A. Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells J. Braz J Med Res, 2003;33：881-887. 3 Majumdar MK, Thiede MA, Mosca JD, et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) and stroma
24、l cells J. J Cell Physiol, 1998;176:57-66. 4 Majumdar MK, Thiede MA, Haynesworth SE, et al. Human marrowderived mesenchymal stem cells（MSCs）express hematopoietic cytokines and support longterm hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages J. Hematother Stem Cell Res, 2000;9：841. 5 Lazzari L, Lucchi S, Rebulla P, et al. Long term expansion and maintenance of cord blood haematopoietic stem cells using thrombopoietin, Flt3lignd, interleukin6 and IL11 in a serum free and stroma free culture system J. Br J Haematol, 2001;112:397-404.
