1、大鼠心脏中神经肽 Y 的 Y1 受体样免疫反应物质的定位作者：鲍岚 张平 程希平 张旭 【关键词】 心脏 关键词: 心脏;大鼠;Y1 受体;神经肽 Y 摘 要:目的 为在细胞水平精确地确定神经肽 Y（NPY）的 Y1 受体样免疫反应物质（-LI）在大鼠心脏中的分布. 方法 用免疫组织化学方法对 Y1 受体 -LI 细胞进行了检测 . 结果 一些心肌细胞含有 Y1 受体-LI，可见清晰的 Y1 受体免疫反应性（-Ir）条纹，此类细胞在心脏呈斑点状分布，接近外膜侧和室间隔的内膜侧分布较多，Y1 受体-LI 主要分布于心肌细胞膜、横小管膜和小泡上;心脏内有 Y1 受体-LI 的心内神经元，此类细胞有
2、较长的突起，呈离散分布，与 Y1 受体-LI 心肌细胞或血管相邻，Y1 受体-LI 神经元的外膜和胞质内有较强的 Y 1 受体-LI，尤以其突起明显. 结论 NPY 对心脏作用的复杂性可能与 Y1 受体在心脏中多种细胞的广泛分布有关. Keywords:heart;rats;Y1 receptor;neuropeptide YAbstract:AIM To accurately localize neuropeptide Y（NPY）Y1 receptor（-R）-like immunoreactivity（-LI）in rat hearts.METHODS Y1 -R immunoreact
3、ive（-Ir）cells were examined with immunohistochemistry.RESULTS Y 1 -R-LI was observed in some cardiomyocytes of rat hearts with a stripe-like pattern in the cells.These cells were scattered in the heart，especially near the outer membrane of the heart and the inner membrane of interventricular septum.
4、Y1 -R-LI was mainly distributed over the plasmalemma of the cell and T tube，and small vesicles.On the other hand，there were dispersed Y1 -R-Ir intrinsic neurons with long processes in the heart，sometimes close to myocardial cells or blood vessels.High level of Y 1 -R-LI was observed near the plasmal
5、emma and the cytoplasm of neurons，especially in their processes.CONCLUSION The complicated effects of NPY on the heart may be related to the extensive distribution of Y1 recep-tor in varied cells of the heart. 0 引言 含神经肽 Y（NPY）的神经纤维分布于整个心脏1 .通常情况下，NPY 与去甲肾上腺素（NA）共存于交感神经元，但大鼠心脏中约有半数的NPY 神经纤维不与 NA 共存，而
6、存在于心内神经元中2 .根据药理学实验研究，NPY 对心脏的作用至少通过两种以上的受体介导，即 Y1 ，Y2 和 Y3 等受体3 .通过受体放射自显影方法观察到心脏有 Y1 受体的结合点4 ，用分子原位杂交方法也观察到人类心脏中有表达 Y1 受体的 mRNA5 .但由于已往的检测方法对组织定位的精确性不够，无法在细胞水平精确地确定受体的位置.本研究用针对 Y1 受体 C 末端肽片段的一种纯化的抗血清6，7 ，用免疫组织化学方法研究大鼠心肌细胞和心内神经元 Y1 受体的分布. 1 材料和方法 1.1 免疫光镜组织化学方法 SD 大鼠（体质量 200250g）10 只（本校实验动物中心提供） ，戊
7、巴比妥钠（50mgkg-1 ，ip）麻醉，经心脏灌注 37生理盐水 50mL 和含 40gL-1 多聚甲醛的0.1molL -1 磷酸缓冲液（PB）50mL，再灌注 4同样固定液250mL，取心脏，放入 4同样固定液后固定 1.5h，200gL-1 蔗糖浸泡 24h 以上，用冰冻切片机（Leica，德国）切 20m 的心脏矢状和冠状切片.根据免疫组织化学方法，将切片放入针对 Y 1 受体 C 末端肽片段的一种纯化的兔抗血清（18000） 6-8 中，用生物素标记的羊抗兔血清（1200）和 Vector ABC 盒（Vector 实验室，美国）孵育，用葡萄糖氧化酶、二甲基联苯胺（DAB）和硫酸镍
8、胺加强法显色，标记物质呈深蓝色，经干燥、透明和 DPX 封片.在 Nikon Microphot-FX 显微镜下观察标本，Leica 图像处理系统（Leica-Q570C，德国）取像，出照片. 1.2 免疫电镜组织化学方法 SD 大鼠 4 只，麻醉、灌注和后固定同上，固定液为含 50mLL -1 戊二醛和 40gL -1 多聚甲醛的 PB.取心脏，切 50100m 振动切片.免疫组织化学方法处理同上，进行常规 DAB 反应，标记物质呈棕色.在 10gL-1 锇酸中处理30min，经梯度乙醇和环氧丙烷脱水后，在 Epon812 中浸润，做平板包埋，聚合后在光镜下定位，取材，在 LKB超薄切片机上
9、切片，不做铅铀染色，在 JEOL-1200 电子显微镜下观察，拍照，出照片. 用制备抗体用的合成的 Y1 受体 C 末端多肽片段以1molL-1 与 Y1 受体抗体预吸收 24h（4）后，做以上免疫组织化学反应，以此检验抗血清免疫标记的特异性. 2 结果 2.1 心肌细胞 大鼠心脏内一些心肌细胞可见中等强度的蓝黑色着色，为 Y1 受体-LI（Fig1） ，可见清晰的 Y1 受体-Ir 标记条纹，为心肌细胞内横小管结构，有的与心脏内 Y 受体-LI 血管相邻（Fig2）.左右心房、左右心室、房间隔、室间隔和房室瓣膜上均有 Y1 标记-Ir 心肌细胞，此类细胞在心脏呈散在的不均匀分布，近心外膜侧分
10、布较多（Fig3） ，尤以左心室最明显，室间隔近心内膜的两侧分布也较多.在电镜下可以观察到一些心肌细胞的外膜上有精细和间断的 Y1 受体-LI 标记，近胞质处有颗粒样的 Y1 受体-LI 标记物，也可见正在内吞的有 Y1 受体-LI 标记的小泡（Fig4）.在横小管两侧膜上有 Y1 受体-LI 标记（Fig5） ，常在相邻的数个横小管中同时出现，也可间隔出现. 2.2 神经元 大鼠心脏内有较强标记的 Y1 受体-Ir 神经元（Fig6，7） ，这些神经元体积小，并有多个突起，有的突起较长，此类细胞在心脏内呈离散分布，单个存在，常与 Y1 受体-Ir 心肌细胞相邻（Fig6）.左右心房、左右心室
11、、房间隔和室间隔上均有此类 Y1 受体-Ir神经元，但在窦房结和房室结周围未见大量的 Y1 受体-Ir 神经元.心内神经元胞体的外膜有较深的点状 Y1 受体-LI 标记，其突起的外膜处也有断续的 Y1 受体-LI 标记，较胞体外膜多（Fig8）.胞体的胞质内有一些与 Y1 受体-LI 标记的外膜相临的 Y1 受体-Ir 小泡，也有一些颗粒状和块状的 Y1 受体-LI，神经元的胞核在胞体中占较大部分，有时在胞膜和胞核间的狭小空间内充满了 Y1 受体-Ir 结构.突起的胞质内有较强的 Y1 受体-Ir 结构，有时充满了一小段突起，有许多 Y1 受体-Ir 小泡，另有一些颗粒状结构.这些含 Y1 受
12、体-LI 的心内神经元可以与周围的心肌细胞相临，在心肌细胞与之相临面可见外膜有 Y1 受体-LI（Fig8）;Y1 受体-LI 的心内神经元也可与心内血管相临，有时与血管腔只有一层内皮细胞之隔（Fig9）. 用经预吸收后的抗血清孵育组织切片，并做免疫组织化学反应后未见有以上描述的阳性结构. 3 讨论 NPY 受体与心脏的变时和变力作用有关9 .我们提供了 Y1 受体存在于心肌细胞和心内神经元的直接形态学证据.在通常情况下，Y1 受体-LI 心肌细胞和心内神经元呈散在的不均匀分布，靠心肌外膜侧较多，左右心房、左右心室、房间隔、室间隔和房室瓣膜上均有分布.Y1 受体在心脏的多种细胞和广泛分布为 N
13、PY 对大鼠心脏变时和变力作用的多样性9 提供了一定的依据. 许多以往的研究显示心脏组织有大量的 NPY 免疫反应阳性神经纤维，心房多于心室10 .同时有研究表明心脏具有多种 NPY 受体，如受体放射自显影配基结合试验结果显示心室膜有 NPY 的结合位点，用选择性的 Y2 受体激动剂 NPY（13-36）结合指示此为 Y2 受体;又如在心室肌，其 NPY 受体对 PYY 和 NPY 的亲合性存在差别，而到目前为止 Y1 和Y2 受体对 PYY 和 NPY 几乎具有同样的亲合性，因此认为在心室肌的结合位点为 Y3 受体11 .药理学实验也进一步证实心脏内有多种 NPY 受体，大鼠心肌细胞至少存在
14、两种接后（postjunctional）NPY 受体，Y1 可能介导 NPY 对心肌细胞的负性收缩反应12 .本研究证实大鼠心肌细胞有 Y1 受体，但呈散在分布，未见心房内有许多 Y1 受体-Ir 的心肌细胞，似与心脏内 NPY 神经纤维的密集和区域密集分布不匹配，有可能这些心肌细胞表达其他类型的 NPY 受体.此外，Y1 受体-Ir 心肌细胞散在分布于较多的 Y1 受体阴性心肌细胞中，NPY 是如何通过具有 Y1 受体的心肌细胞对整体心肌产生作用尚待进一步研究. 图 1 图 9 略 在电镜下可清晰地观察到大鼠一些心肌细胞的外膜和横小管膜上及胞质中有 Y1 受体-LI，且存在于小泡中.Y1 受
15、体为 G 蛋白偶联超家族受体，NPY 作用于接后 Y1 受体时，通过抑制性的 G 蛋白，可能对心肌产生负性肌力作用9 ，在这一过程中，均可引起细胞内钙离子变化.通常情况下，心肌细胞经横小管将兴奋传向终池，使肌浆网膜上的钙泵活动，肌浆内的钙离子浓度发生改变，从而引起心肌一系列变化13 .NPY 可能通过作用于心肌外膜和横小管膜上的 Y1 受体，对心肌收缩力产生影响. 我们的研究表明，大鼠心脏有较强的 Y1 受体-Ir 神经元，并具有较长的突起，可能为心内神经元，心内神经元主要为迷走神经的节后神经元，可单个存在.有研究报道心内神经元中有 NPY 反应阳性神经元14 ，因此来自心内神经元自分泌或旁分
16、泌的 NPY 对其自身有调节作用，也可对其周围的心肌细胞产生作用，这也为 Y1 受体可以是接前（prejunctional）受体提供了新的证据.已有的研究发现大鼠心脏有一种小强荧光细胞位于心肌细胞之间，有的在有孔毛细血管周围，可释放儿茶酚胺或其他物质到组织间隙或血管内，以内分泌和旁分泌的方式起局部调节作用15 .我们的研究发现 Y1 受体-LI 的心内神经元可与心内血管相临，特别是有时与血管腔只有一层内皮细胞之隔，因此 Y1 受体-LI 的心内神经元也可能是此小强荧光细胞，NPY 通过对接前 Y1 受体的作用，除对乙酰胆碱的释放起调节作用外，对儿茶酚胺或其他物质的释放也起调节作用. 参考文献:
17、 1Wharton J，Gulbenkian S.Peptides in the mammalian cardiovas-cular system J.Experentia Suppl，1989;56:292-316. 2Corr LA，Aberdeen JA，Milner P，Lincoln J，Burnstock G.Sympathetic and nonsympathetic neuropeptide Y-containing nerves in the rat myocardium and coronary arteries J.Circ Res，1990;66（6）:1602-160
18、9. 3Grundemar L，Hakanson R.Multiple neuropeptide Y receptors are involved in cardiovascular regulation.Peripheral and central mechanisms J.Gen Pharm，1993;24（4）:785-796. 4Wahlestedt C，Regunathan S，Reis DJ.Identification of cultured selectively expressing Y 1 -， Y2 -or Y3 -type receptors for neu-ropep
19、tide Y/peptide YY J.Life Sci，1992;50（4）:PL7-PL12. 5Wharton J，Gordon L，Byrne J，Herzog H，Selbie LA，Moore K，Sullivan MH，Elder MG，Moscoso G，Taylor KM.Expres-sion of the human neuropeptide tyrosine Y1 receptor J.Proc Nalt Acad Sci USA，1993;90（2）:687-691. 6Zhang X，Bao L，Xu ZQ，Kopp J，Arvidsson U，Elde R，Hok
20、-felt T.Localization of neuropeptide Y Y1 receptors in the rat nervous system with special reference to somatic receptors on small dorsal root ganglion neurons J.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91（24）:11738-11742. 7Bao L，Kopp J，Zhang X，Xu ZQ，Zhang LF，Wong H，Walsh J，Hokfelt T.Localization of neuropeptide
21、 Y Y1 receptors in cerebral blood vessels J.Proc Natl Acad Sci USA，1997;94（23）:12661-12666. 8Bao L，Lin YH，Zhang X.Distribution of neuropeptide Y Y1 re-ceptor-like immunoreactivity in rat coronary blood vessels J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2000;20（1）:1-5. 9McDermott BJ，Millar BC
22、，Piper HM.Cardiovascular effects of neuropeptide Y:Receptor interactions and cellular mechanisms J.Cardiovasc Res，1993;27（6）:893-905. 10Gu J，Polak JM，Allen JM，Huang WM，Sheppard MN，Tate-moto K，Bloom SR.High concentration of a novel peptide，neu-ropeptide Y，in the innervation of mouse and rat heart J.J
23、 Histochem Cytochem，1984;32（5）:467-472. 11Balasubramaniam A，Sheriff S，Ferguson DG，Stein M，Rigel DF.Characterization of neuropeptide Y binding sites in rat car-diac ventricular membranes J.Peptides，1990;11（6）:545-550. 12Michel MC，Schlicker E，Fink K，Boublik JH，Gothert M，Wil-lette RN，Daly RN，Hieble JP，
24、Rivier JE，Motulsky HJ.Dis-tinction of NPY receptors in vitro and in vivo.I NPY（18-36）discriminates NPY receptor subtypes in vitro J.Am J Physi-ol，1990;259（1Pt1）:E131-E139. 13Gu HY.Jizuzhi（Muscle） A.In:Cheng LZ.Zuzhixue Yu Peitaixue（Histology and embryology） M.4th ed.Beijing:Remin Weisheng Chubanshe（
25、Peoples Healthy Publishing House） ，1989:66-74. 14Gulbenkian S，Edvinsson L，Saetrum Opgaard O，Valenca A，Wharton J，Polak JM.Neuropeptide Y modulates the action of vasodilator agents in guinea-pig epicardial coronary arteries J.Regul Pept，1992;40（3）:351-362. 15Lin FD，Li JS.Xinzang de shenjin（Cordis nerves） A.In:Lin FD，Lin Q.Xinzang linchuang jiepouxue（Clinic anatomy of the heart） M.Xian:Shaanxi Kexue Jishu Chubanshe（Shaanxi Scientific and Technique Publishing House） ，1996:123-131.
