1、电离辐射对人鼻咽癌细胞株 CNE2Z 体外表达血管内皮生长因子的影响【摘要】 目的 探讨电离辐射对人鼻咽癌细胞体外表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响。方法 人鼻咽癌细胞株 CNE2Z 置 RPMI 1640 培养液培养，实验分为两组，剂量梯度组分别给予 2、4、6、8、12、16 Gy电离辐射；时间梯度组给予 6 Gy 照射；收集细胞上清液，双抗体夹心ELISA 法测定 VEGF 表达水平。结果 与阴性处理细胞比较，人鼻咽癌细胞株 CNE2Z 体外接受不同剂量辐照后，VEGF 表达明显增高，且具有剂量依赖性和时程依赖性。结论 电离辐射能诱导人鼻咽癌细胞 VEGF 高表达，这可能是临床肿瘤抗
2、辐射的机制之一。 【关键词】 电离辐射；鼻咽癌细胞；血管内皮生长因子 【Abstract】 Objective To investigate the effects of ionizing radiation (IR) on vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in nasopharygeal carcinoma cells.Methods CNE2Z nasopharygeal carcinoma cells were maintained in RPMI 1640 medium and exposed to IR in
3、incremental doses of 2,4,6,8,12,16 Gy. These cells were cultured different time after exposure, and the media were harvested for measurement of VEGF protein levels by ELISA. Results Exposure of CNE2Z cells to IR induced significant upregulation of VEGF expression. VEGF levels exhibited an IR and tim
4、edependent increase in comparison with the control unirradiation cells. Conclusion IRmediated induction of VEGF in nasopharyngeal carcinoma cells may contribute to clinically tumour radioresistance. 【Key words】 ionizing radiation, nasopharyngeal carcinoma, VEGF 鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，放射治疗是其首选的治疗手段，局部复发和远处转
5、移仍是治疗失败的主要原因。恶性肿瘤的生长和转移依赖于血管生成，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是最重要的与血管生成有关的因子 。在放射治疗过程中，有关 VEGF 表达变化的研究国内少有报道，对此，我们初步探讨如下。 1 材料与方法 1.1 细胞培养及照射 取对数生长期细胞制成 1105/ml 单细胞悬液，2 ml/孔接种于六孔板中，待细胞贴壁后（约 12 h） ，采用 Siemens直线加速器 6 MeV X 射线，吸收剂量率 2 Gy/min，源皮距 100 cm，射野大小 10 cm20 cm，从下向上照射。实验分为两
6、组：剂量梯度组分别给予 0、2、4、6、8、12、16 Gy 照射；时间梯度组给予 6Gy 照射。 1.2 条件培养液的收集 剂量梯度组于照射后 24 h，时间梯度组于照射后 0、12、24、36、48 h 时间点终止培养，收集细胞培养液，转移至 1.5 ml Eppendorf 管，4，2 000 r/min 离心 5 min，吸取上清液-20冷冻保存备用。 1.3 条件培养液 VEGF 浓度的测定 采用双抗体夹心 ELISA 法测定细胞上清液 VEGF。人 VEGF ELISA 试剂盒购自中杉生物工程公司，具体操作按说明书进行。 1.4 数据分析与统计 实验数据资料统计采用统计学软件 SP
7、SS 10.0 进行单因素方差分析。 2 结果 不同剂量射线照射 24 h 后，CNE2Z 细胞 VEGF 的表达均增高。4 Gy时最高，后随剂量的增加有所下降，与对照组 0 Gy 比较，差异均有显著性（P005 ） ，见表 1。 表 1 不同剂量照射 24 h 后 CNE2Z 细胞培养液中 VEGF 浓度 略 6 Gy 照射后，各时间点条件培养液中 VEGF 的含量逐渐升高，36 h时与 0 h 比较，差异有显著性（P0.01） ，到 48 h 时达最高水平,与对照组 0 h 时比较，差异有极显著性（P001 ） ，见表 2。 表 2 照射后不同时间 CNE2Z 细胞培养液中 VEGF 浓度
8、 6 Gy 照射后时间（略） 3 讨论 放射治疗失败的主要原因有肿瘤细胞的放射抵抗性、肿瘤细胞的远处转移等。低氧是导致肿瘤放射抵抗的一个重要原因2 ，低氧能诱导肿瘤细胞表达 VEGF，放射也可以诱导 VEGF 的高表达3，4 。肿瘤细胞产生的 VEGF 不仅以旁分泌方式刺激血管生成，而且以自分泌方式刺激肿瘤细胞自身的生长。VEGF 可能在肿瘤细胞以及肿瘤血管内皮细胞经过放射损伤后的修复过程中发挥一定的作用5 。放射治疗不仅对肿瘤细胞有直接或间接杀伤作用，还具有封闭肿瘤血管的作用，可使血管内皮细胞退化、变性。随着肿瘤缩小，肿瘤微血管更加迂曲、变形、管腔缩小，血流缓慢，血栓形成，使肿瘤微血管进入封
9、闭状态6 。然而，已有文献报道，放射治疗本身也可引起肿瘤血管生成活跃，VEGF 分泌增加79 。其机制可能是：肿瘤细胞受照射的应激保护性反应。电离辐射激活转录所需的 PKC（蛋白激酶 C）信号转导系统，促进 VEGF 等多种细胞因子表达。放射治疗还可以激活 EGFR，通过 MAPKS 信号传导通路，调节 TGF 、VEGF 等生长因子表达增加。放射治疗还直接激活MAPKS，应激相关蛋白激酶和 ras 相关激酶等改变细胞增殖状态，使肿瘤细胞得以生存。放射治疗促进 VEGF 表达和血管生成，无效的血管生成使乏氧细胞增加，乏氧细胞增加又促进血管生成，如此恶性循环，最终导致肿瘤对放射治疗产生抗性。Go
10、rski 等10研究证实 Lewis 肺癌细胞体外接受电离辐射后，VEGF 的表达明显增高，移植瘤辐射后瘤体组织 VEGF 增加。本文结果显示，与未受辐射细胞比较，人鼻咽癌细胞系 CNE2Z 体外接受不同剂量的辐射后，VEGF 的表达也明显增高，且随辐射剂量的增加、辐射后时间的延长，效应越加显著。提示电离辐射诱导肿瘤细胞 VEGF 高表达，可能是肿瘤治疗过程中产生放射抵抗性的机制之一，推测放射治疗联合抗 VEGF 的抗血管生成治疗可能会取得理想的抗肿瘤效应。虽然从理论上讲抗血管生成治疗导致血管的退行性变，引起肿瘤内的缺氧状况，导致肿瘤细胞的放射抵抗性，但是大量的实验证据已经驳斥了这种观点11
11、。放射治疗联合抗血管生成治疗可以有协同作用并非仅仅是相加作用。随着抗血管生成治疗与放射敏感性机制的研究深入，以及抗血管生成方法和药物不断发现，可以乐观地预计抗血管生成在肿瘤放射治疗中会日益受到重视，并成为肿瘤综合治疗的重要措施之一。 【参考文献】 1 Gupta VK, Jaskowiak NT, Beckett MA,et al. Vascular endothelial growth factor enhances endothelial cell survival and tumor radioresistanceJ. Cancer J, 2002,8(1): 4754. 2 Brize
12、l DM, Sibley GS, Prosnitz LR,et al. Tumor hypoxia adversely affects the prognosis of carcinoma of the head and neckJ. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1997,38(2):285289. 3 Moeller BJ, Cao Y, Li CY,et al. Radiation activates HIF1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: Role of reoxygenation, fr
13、ee radicals, and stress granulesJ. Cancer Cell, 2004,5(5):429441. 4 Semenza GL. Intratumoral hypoxia, radiation resistance, and HIF1 J.Cancer Cell, 2004,5(5):405406. 5 Geng L, Donnelly E, McMahon G,et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signaling leads to reversal of tumor
14、resistance to radiotherapyJ. Cancer Res, 2001,61(6):24132419 . 6 Denis F, Colas S, Chami L,et al, Changes in tumor vascularization after irradiation, anthracyclin, or antiangiogenic treatment in nitrosomethyl ureasinduced rat mammary tumorsJ. Clin Cancer Res, 2003,9(12):45464552. 7 Park JS, Qiao L,
15、Su ZZ,et al, Ionizing radiation modulates vascular endothelial growth factor (VEGF) expression through multiple mitogen activated protein kinase dependent pathwaysJ. Oncogene, 2001,20(25):32663280. 8 Wachsberger P, Burd R, Dicker AP. Tumor response to ionizing radiation combined with antiangiogenesi
16、s or vascular targeting agents: exploring mechanisms of interactionJ. Clin Cancer Res, 2003,9(6):19571971. 9 Brown CK, Khodarev NN, Yu J,et al. Glioblastoma cells block radiationinduced programmed cell death of endothelial cellsJ. FEBS Lett, 2004, 565(13):167170. 10 Gorski DH, Beckett MA, Jaskowiak
17、NT,et al. Blockade of the vascular endothelial growth factor stress response increases the antitumor effects of ionizing radiationJ. Cancer Res, 1999, 59(14):33743378. 11Raben D, Helfrich B. Angiogenesis inhibitors: a rational strategy for radiosensitization in the treatment of nonsmallcell lung cancerJ? Clin Lung Cancer, 2004, 6(1):4857.
