1、电针对局灶性脑缺血大鼠缺血区皮层神经生长因子表达的影响作者：易玮， 许能贵， 汪帼斌， 佘世锋， 徐振华， 赖新生 【关键词】 脑缺血针灸疗法；,神经生长因子针灸效应；,百会,穴；,大椎,穴；,疾病模型,动物；,大鼠 摘要：【目的】探讨针刺对缺血性脑损伤的保护作用。 【方法】SD大鼠 36 只，随机分为假手术组、缺血模型组和电针组，每组又分为 2 周和 5 周两个时间段组；除假手术组外，其他组均采用热凝闭大鼠大脑中动脉法复制局灶性脑缺血模型，采用免疫组化法观察缺血 2 周和 5 周后缺血区皮层神经生长因子(NGF)的变化规律以及针刺对其影响。 【结果】两个假手术组大鼠手术侧皮层只见到很少的 N
2、GF 免疫阳性细胞；两个缺血组大鼠脑缺血区皮层 NGF 免疫活性细胞的表达与假手术组比较显著增多（） ，缺血 5 周组与缺血 2 周组相比缺血区皮层 NGF 阳性细胞的数量下降（） ；电针组在 2 周时缺血区皮层 NGF 免疫阳性细胞的表达增高，与缺血 2 周组、假手术 2 周组相比差异具有显著性意义（） ；电针 5 周组大鼠脑缺血区皮层 NGF 免疫阳性细胞表达虽呈下降趋势，但仍高于同时间段的缺血组大鼠（） 。 【结论】电针可以增加大鼠脑缺血区皮层 NGF 的分泌和表达时程，这可能是其保护缺血性脑损伤的机制之一。 关键词：脑缺血针灸疗法； 神经生长因子针灸效应； 百会，穴； 大椎，穴； 疾病
3、模型，动物； 大鼠 神经生长因子(NGF)是由神经元自身所支配的靶组织产生的特异蛋白分子，通过神经元轴突逆行运输到神经元胞体，与特异的神经细胞受体结合，激活细胞代谢，调节细胞生长。NGF 在脑内的含量虽少，但对神经细胞的发育、成熟和存活起着极为重要的作用。神经生长因子的供应数量是有限的，神经元在发育过程中，得到神经生长因子的细胞才能生存，得不到的则死亡，存在一种竞争关系 。而在病理情况下，NGF 起着保护神经元避免损伤的作用，可以提高神经元的存活2 。由于 NGF 在脑损伤时对神经细胞具有重要的保护作用和促进神经细胞功能恢复的作用，因而成为国内外学者研究的热点。不同原因的脑损伤均可引起 NGF
4、表达的增加，一般在脑缺血后 2?h NGF 表达就出现，表达时程依缺血时间长短和程度轻重而不同。已有研究表明 ，急性脑缺血损伤后 NGF的表达对神经细胞具有重要的保护作用和促进神经元功能恢复作用，为求证 NGF 是否参与脑缺血损伤后期对神经元的保护过程，本实验观察了不同时间段脑缺血大鼠缺血区皮层 NGF 的表达及电针对其干预作用。现报告如下。 1 材料与方法 11 动物 健康纯种 SD 大鼠 36 只(由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：000000250)，雌雄各半，体质量 180240?g。自来水喂养，饲以普通颗粒型大鼠饲料(含蛋白?230?g/kg，脂肪 47?g/kg，钠盐 2
5、4?g/kg)，动物房温度控制在 1826，光暗周期各 12?h。由抽签法随机分为假手术组、缺血模型组和电针组，每组又分为 2 周和 5 周两个时间段组，共 6 小组，每小组 6 只大鼠。其中缺血模型 2 周组在第 3 天时死亡 1 只。12 试剂与仪器 40?g/L 多聚甲醛；001?mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)；体积分数为 3%的 ；牛血清白蛋白(BSA)；二氨基联苯胺(DBA)；聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX） ；第一抗体为羊抗大鼠 NGF 抗体(Chemicon 公司产品，购于深圳晶美公司)；生物素标记的第二抗体为兔抗羊 IgG(Chemicon公司产品，购于深圳晶美公司)；
6、普通光学显微镜(） ；号 1寸毫针(华佗牌，苏州医疗用品厂生产)；G?6805电针治疗仪(青岛华青仪器厂)。 13 模型复制 采用热凝闭大脑中动脉法复制局灶性脑缺血(MACO)模型 。具体方法是用 100?g/L 水合氯醛溶液，按 400?mg/kg 剂量腹腔麻醉；取右上侧卧位固定，沿耳眼连线中点切开皮肤，分离颞肌，暴露颞骨作一骨窗，轻抬脑，显露大脑中动脉，用烧红的不锈钢丝轻触大脑中动脉，使之凝闭，复制局灶性脑缺血模型；其中假手术者只作手术暴露大鼠大脑中动脉，不予凝闭；电针组立即给予电针治疗。 14 治疗方法 141 穴位选择 穴位选取督脉经的百会、大椎 2 穴，其定位参照大鼠的常用针灸穴位：
7、“百会”位于顶骨正中；“大椎”在第 7 颈椎与第 1 胸椎间，背部正中。 142 刺法 电针组大鼠以 30 号 1 寸毫针斜刺百会 05 寸(同身寸)，直刺大椎 05 寸，将针柄分别连接至电针仪上，510?z，疏密波，强度以大鼠安静耐受为度，一般 35?V，时间 30?min。每天 1 次，均在上午 10 点左右进行，分别连续治疗 2 周(2 周组)和 5 周(5 周组)。假手术组和缺血模型组大鼠只在同等条件下饲养，未予任何处理。 15 标本采集及处理 2 周及 5 周后，分别取出大鼠，100?g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏快速灌流生理盐水 100?mL，然后用 40?g/L 多聚甲醛(4
8、)灌流固定30?min；断头取脑，放入 40?g/L 多聚甲醛进行后固定 46?h，然后分别置于 150、200、300?g/L 的梯度蔗糖脱水；待脑组织下沉后取出做冰冻切片，片厚 40?m，取缺血中心的脑片(前囟前 0108?mm)进行免疫组织化学染色。 16 免疫组织化学染色 切片入 001?mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7274)漂洗 3 次，每次5?min；再入体积分数为 3%的中漂洗 10?min，然后放入含10?g/L BSA 和 2?g/L Triton X的 PBS 溶液中 20?min，将切片放入稀释后的第一抗体中，37孵育 2?h，移入 4冰箱孵育 30?h；经
9、PBS 漂洗 3 次，切片入生物素标记的第二抗体，37孵育 1?h，PBS 漂洗 3 次；切片挑入 05?g/L DAB(含体积分数为 010%的）中，显色后入 PBS漂洗 3 次，贴片，晾干，梯度酒精脱水后晾干，入二甲苯溶液 2 次，每次各 5?min，苏木素复染，最后多聚树胶封片。对照实验以正常羊血清和PBS 代替一抗，同步进行上述免疫组织化学染色，结果为阴性。 17 细胞计数及统计 光镜下(）对假手术组、缺血模型组和电针组手术侧皮层的免疫阳性细胞进行计数，每组计算 18 张切片、每张切片计算 3 个非重叠视野的免疫阳性细胞数目，并进行方差分析检验。 2 结果 NGF 的免疫阳性颗粒分布在
10、神经元胞浆内，两个假手术组大鼠手术侧皮层只见到很少的 NGF 免疫阳性细胞。两个缺血模型组(2 周组和 5 周组)大鼠脑缺血区皮层 NGF 免疫活性细胞表达明显增多，与假手术组比较具有显著性差异（） ；缺血 5 周组与缺血 2 周组相比，缺血区皮层 NGF 阳性细胞的数量下降（） 。电针组在 2 周时缺血区皮层NGF 免疫阳性细胞的表达增高，与缺血 2 周组及假手术 2 周组比较具有显著性差异（） ；电针 5 周组大鼠缺血区皮层 NGF 免疫阳性细胞表达虽呈下降趋势，仍高于同时间段的缺血组大鼠（） 。结果见表 1、图 1。表 1 电针对 MACO 模型大鼠脑缺血灶周围皮层 NGF 阳性细胞数的
11、影响 3 讨论 神经生长因子(NGF)是 LeviMontalcini 等于 20 世纪 50 年代发现的第1 个神经营养因子。自 20 世纪 80 年代中期发现脑内存在 NGF 的 mRNA、蛋白及 NGF 受体以来，NGF 与中枢神经系统(CNS)疾病的关系及运用 NGF防治 CNS 疾病的研究就越来越广泛和深入。在生理情况下，NGF 在脑内的含量高低依次为海马、大脑皮质、嗅球、基底前脑、小脑、纹状体 。NGF 在脑内含量虽微，但在神经系统内对神经元的生存、分化、生长起着重要作用，特别在轴突的生长和细胞的存活方面起着非常重要的作用。研究表明，NGF 能抑制中枢神经元因缺血而导致的程序性细胞
12、死亡，增加自由基清除剂的活性，减轻缺血神经细胞损伤，促进受损神经元的再生 。NGF 能促进脑缺血后运动功能和记忆的恢复，减少锥体神经元树突的萎缩 。 Hsu的研究发现，将大鼠右侧大脑中动脉闭塞 30?min 再开放，4?h 后缺血侧皮质 NGF 表达增加，13?d 表达明显受抑制，但 12 周出现第 2 次高峰。Lee的研究证明，在大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型中，非缺血皮质内 NGF 的免疫活性从缺血 4?h 开始升高，第 3 天升高明显，第 7 天达到高峰，至第 14 天 NGF 免疫活性恢复到正常水平；半影区 NGF 活性在缺血开始时出现短暂下降，第 3 天开始上升，第 14 天恢复至正常
13、水平。研究表明，NGF 能使神经元前体细胞增殖，对胆碱能神经元、单胺类神经元、肽能神经元、交感神经元、 氨基丁酸能神经元均具有支持存活作用，NGF 可以增加神经递质的合成，阻止神经元细胞程序性死亡 ，NGF 可以通过减少细胞内钙超载来拮抗脑缺血后过度兴奋和氨基酸的兴奋毒性以起到神经保护剂的作用 。缺血性脑损伤时NGF 表达增加对于保护神经细胞、提高神经元存活率具有重要意义，NGF表达时程越长，对受损神经元的保护作用越全面、持久。本实验结果显示，MACO 模型大鼠在造模 2 周后缺血区皮层有大量 NGF 阳性细胞表达，在 5 周时 NGF 表达虽有下降，但仍高于正常水平(与假手术组相比)，结果与
14、上述研究的结论一致。因为本实验只选取两个时间点，所以无法看出 NGF 在 MACO 模型大鼠缺血区皮层的表达规律。但从实验结果可以看出，电针治疗组在 2 周时缺血区皮层 NGF 的阳性表达高于缺血组和假手术组，在 5 周时虽已成下降趋势，仍高于同时段的模型组。提示电针能提高MACO 模型大鼠缺血区皮层 NGF 的分泌，延长缺血区皮层 NGF 表达时程，是其促进脑缺血后康复的机制之一，具体作用环节有待进一步研究。 参考文献： 1Yuen E C,Mobley W CTherapeutic potential of neurotrophic factors for neurological dis
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