1、端粒酶正义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长的作用作者：张素珍 黄培春 徐永 陈锦 蔡康荣 【关键词】 鼻咽肿瘤 关键词: 鼻咽肿瘤;端粒酶;正义寡核苷酸;细胞周期 摘 要:目的 探讨端粒酶正义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长的作用. 方法 脂质体介导端粒酶正义、反义及无义寡核苷酸转染鼻咽癌 CNE1 和CNE2Z 细胞，MTT 法检测细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞周期. 结果 端粒酶正义寡核苷酸与反义寡核苷酸一样可抑制鼻咽癌 CNE1 和 CNE2Z 细胞的生长，且呈剂量和时间依赖性.1.5molL-1 正义寡核苷酸与 CNE1 细胞共培养 6，12，24 和 48h 时抑制率分别为16.3%，15.6%，
2、20.2%和 26.3%，浓度为 4.5molL-1 时抑制率分别为 22.5%，21.5%，32.4%和 39.9%;在 CNE2Z 细胞，浓度为1.5molL-1 时抑制率分别为 7.7%，25.2%，27.0%和 28.8%，浓度为 4.5molL-1 时抑制率分别为 18.1%，30.1%，32.8%和32.9%;同时流式细胞仪检测到凋亡峰，含量分别为 25.3%和 19.3%.无义寡核苷酸无此作用. 结论 端粒酶正义寡核苷酸可抑制鼻咽癌细胞的生长. Keywords:nasopharyngeal neoplasms;telomerase;sense oligodeoxynucleot
3、ides;cell cycle Abstract:AIM To investigate the effects of telomerase sense oligodeoxynucleotide on the growth of nasopharyngeal carcinoma cells.METHODS Telomerase sense oligodeoxy-nucleotide（SODN） ，antisense oligodeoxynucleotide（A-SODN）and nonsense oligodeoxynucleotide（NODN）were introduced into nas
4、opharyngeal carcinoma CNE1and CNE2Z cells by using lipofectin mediation，the proliferation of cells was measured by MTT method，and cell cycle were measured with flow cytometer（FCM）.RESULTS SODN inhibited the growth of CNE1and CNE2Z cells as well as ASODN，and presented dose-and time-dependent manner.A
5、fter being treated with1.5molL-1 SODN for6，12，24and48h，the inhibition rates were16.3%，15.6%，20.2%and26.3%respectively in CNE1cells，and7.7%，25.2%，27.0%and28.8%respectively in CNE2Z cells;with4.5molL-1 SODN，the inhibition rates were22.5%，21.5%，32.4%and39.9%in CNE1cells，and18.1%，30.0%，32.8%and32.9%in C
6、NE2Z cells.Meanwhile，the apoptotic peaks were detected with FCM and the quantity were25.3%and19.3%respectively.NODN had no inhibitory effect on CNE1and CNE2Z cells.CONCLUSION The telomerase SODN could inhibit the growth of nasopharyngeal carcinoma cells. 0 引言 端粒是位于染色体末端的特殊 DNA 重复序列，其长度的维持除端粒酶激活途径外，还
7、有其他非酶途径，但具体情况还不清楚1-4 .端粒酶 RNA 是合成端粒的模板，因此，针对端粒酶 RNA（telomerase RNA，hTR）模板区的端粒酶正义寡核苷酸可以和端粒 DNA 互补结合.这种结合是否能影响端粒长度的维持，从而影响肿瘤细胞的生长，是一个有意义的问题.我们通过应用端粒酶正义寡核苷酸作用于鼻咽癌 CNE1 和CNE2Z 细胞，观察鼻咽癌细胞的生长状况，来探讨端粒酶正义寡核苷酸对肿瘤细胞生长的影响，为肿瘤防治提供新思路. 1 材料和方法 1.1 材料 高分化鼻咽癌细胞株 CNE1 和低分化鼻咽癌细胞株 CNE2Z为本室提供，常规培养于含 100mLL-1 新生小牛血清的RP
8、MI1640 培养液中，实验用对数生长期细胞.端粒酶正义寡核苷酸（sense oligodeoxynucleotide，SODN） 、反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASODN）及无义寡核苷酸（nonsense oligodeoxynucleotide，NODN）由上海博彩生物技术公司合成，全硫代修饰;SODN 序列:5-CTA ACC CTA AC-3，与 hTR 模板区合成端粒的 11个碱基序列（4656）完全相同，ASODN 序列:5-GTT AGG GTT AG-3，互补于 hTR 模板区合成端粒的 11 个碱基序列（4656）. 1.2 方
9、法 寡核苷酸的脂质体包裹转染及分组:寡核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN）分别溶于不含血清及抗生素的 RPMI1640培养液中，加入同样方法稀释的阳离子脂质体 lipofectin（Gibco）液中，二者混匀，室温放置 1015min，使之形成脂质体-ODN 复合物，用于转染.转染前，用无血清无抗生素培养液漂洗细胞 1 次，分为SODN，ASODN，NODN，脂质体和空白对照组.分别加入终浓度为1.5，3.0，4.5 和 6.0molL -1 的 SODN 及终浓度为 4.5molL-1 的 ASODN 和 NODN，脂质体组加入只含脂质体的无血清无抗生素培养液，空白对照
10、组加入相同量的无血清无抗菌素培养液.培养 24h 时，再加入 1/3 初始剂量的SODN，ASODN，NODN，脂质体培养液及空白培养液.细胞增殖能力检测采用 MTT 法:对数生长期细胞接种于 96 孔培养板，细胞密度为 2.5107 L-1 ，每孔 0.2mL.在 ODN 与细胞共培养 6，12，24 和 48h 时加MTT（5gL-1 ）10L，继续培养 4h，吸出培养液，加DMSO100L孔-1 ，全自动酶标仪测定波长 570630nm 的 A 值.每组设 4 个复孔，实验重复 3 次，计算各组均值.并计算生长抑制率（未处理组 A 值-处理组 A 值）/未处理组 A 值100%.细胞周期
11、分析采用流式细胞仪检测:终浓度为 4.5molL-1 的 SODN，ASODN和 NODN 与细胞共培养 48h 后，收集细胞，750mLL-1 乙醇固定，检测前离心去乙醇，加入 50mgL-1 PI（碘化丙锭）0.5mL，4避光 30min，上机检测. 统计学处理:实验数据以 x s 表示，显著性差异采用 t 检验. 2 结果 2.1 SODN 对 CNE1 和 CNE2Z 细胞增殖的影响 SODN 对 CNE1 和 CNE2Z细胞生长表现明显的抑制作用，并呈浓度、时间依赖性.浓度为1.5molL-1 时，在 CNE1 细胞培养 24h 开始出现抑制作用，在CNE2Z 细胞，培养 12h 时
12、即出现抑制作用（Tab1） ，且抑制率随浓度的增加和时间的延长而增强.A-SODN 对 CNE1 和 CNE2Z 细胞的生长也表现明显的抑制作用，并随时间延长抑制作用增强.NODN 和脂质体处理组及空白对照组的 CNE1 和 CNE2Z 细胞生长不受影响（Tab2）. 表 1 端粒酶正义寡核苷酸对 CNE1 和 CNE2Z 细胞生长的影响 略 2.2 SODN 对 CNE1 和 CNE2Z 细胞周期的影响 CNE1 和 CNE2Z 细胞用4.5molL-1 SODN 处理 48h 后，FCM 检测，结果在 G1 期前有凋亡峰存在，凋亡细胞分别占全部细胞的 25.3%和 19.3%（Fig1）.
13、4.5molL-1 ASODN 作用后也检测到凋亡峰，其他组未见凋亡峰. 3 讨论 无限增殖是癌细胞的显著特征之一，其原因目前还不清楚.研究表明，端粒酶激活即可维持端粒长度，并赋予细胞无限增殖能力.肿瘤细胞及永生化细胞即表现如此5，6 .应用端粒酶反义核酸封闭端粒酶 RNA，或用端粒酶逆转录酶反义核酸封闭逆转录酶的表达，可抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，从而抑制肿瘤细胞的生长8-10 .我们应用互补于端粒酶RNA 模板区的反义核酸封闭端粒酶活性后，CNE1 和 CNE2Z 细胞生长均受到抑制，说明端粒酶激活，端粒一定长度的维持在鼻咽癌细胞生长中起重要作用.但有意义的是我们首次观察到应用端粒酶正义核酸
14、（相当于端粒反义核酸） ，同样可使鼻咽癌细胞的生长受到抑制，且呈剂量和时间依赖性，而无义寡核苷酸无此作用. 表 2 端粒酶正义寡核苷酸对 CNE1 和 CNE2Z 细胞生长抑制率的比较 略 图 1 流式细胞仪检测结果 略 端粒长度的调节除有端粒酶活性机制外，还有其他非酶机制1-4 .FCM 测定结果提示，端粒酶正义核酸抑制肿瘤细胞生长的作用还可能与促进细胞凋亡有关.至于端粒酶正义核酸抑制肿瘤细胞生长有无广泛性及其抑制生长的机制尚需进一步研究. 参考文献: 1Bolzan AD，Paez GL，Bianchi MS，Biamchi NO.Analysis of telomere repeats
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