1、肝癌相关抗原 HAb18G 反义 RNA 表达质粒的构建及克隆鉴定 作者：李郁 陈志南 邢金良 郭小楠 黄宝成 【关键词】 肝肿瘤 关键词: 肝肿瘤;遗传载体;RNA，反义;HAb18G/CD147 摘 要:目的 构建 HAb18G 反义 RNA 表达质粒载体. 方法 用 DNA 重组技术将人 HAb18G 基因反向克隆到真核表达质粒 PCI-neo 中，构建成HAb18G 反义 RNA 表达质粒 PCI-asHAb18G.用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系 HHCC，经 G418 筛选后获得的克隆进行鉴定. 结果 HAb18G 反义 RNA 表达质粒载体 PCI-asHAb18G 经限制性酶
2、切及部分序列分析证明基因插入正确.流式细胞仪及免疫组化 SP 法染色均证实:转染细胞HHCC/asHAb18G 中 HAb18G 表达为阴性，而转染空载体的 HHCC/neu 及HHCC 均为强阳性. 结论 成功构建了 HAb18G 反义 RNA 表达质粒载体PCI-asHAb18G.为进一步研究 HAb18G 蛋白分子的生物学功能及肝癌的基因治疗研究奠定了基础. Keywords:liver neoplasms;genetic vectors;RNA，anti-sense;HAb18G/CD147 Abstract:AIM To construct eukaryotic vector exp
3、ressing antisense RNA of HAb18G.METHODS PCI-asHAb18G was constructed by inserting HAb18G cDNA reversely to eu-karyotic expression vector PCI-neo.The hepatoma cell strain HHCC was transfected by PCI-asHAb18G.After selected by G418，positive clones were identified by fluorocytometry as-say and indirect
4、 immunofluorescence staining.RESULTS It was verified that construction of the eukaryotic antisense RNA expression vector PCI-asHAb18G was correct by partial nucleotide sequencing and restriction endonuclease digestion.Indirect immunofluorescence staining and fluorocytometric assay show that the expr
5、ession of HAb18G was negtive in HHCC transfected by PCI-asHAb18G and its expression was positive in HHCC transfected by PCI-neo and untransfected HHCC.CONCLUSION These results lay the foundation for further study of the biological functions of HAb18G/CD147and gene therapy for hepatoma. 0 引言 HAb18 是我
6、室用肝癌抗原免疫小鼠得到的特异性单克隆抗体（mAb）1 ，该 mAb 药物已进入期临床2 .我们构建了人肝癌组织 cDNA文库3 并用 HAb18mAb 从其中筛选得到其相应抗原 HAb18G，查询Genebank 发现其基因序列与 CD147 分子序列一致.CD147 分子，又名EMMPrin（细胞外基质金属蛋白酶诱导因子） ，最初源于人肺癌细胞系 LX-1，在肝癌组织中发现尚属首次，它具有刺激成纤维细胞产生基质金属蛋白酶（MMPs）的功能4 .MMPs 能降解细胞外基质因而在肿瘤的侵袭和转移中起到重要的作用5 .为研究 HAb18G 与肝癌转移的关系，我们构建 HAb18G 反义 RNA
7、真核表达质粒，并观察其对人肝癌细胞 HAb18G 的表达的抑制作用. 1 材料和方法 1.1 材料 质粒 pBluescript ks（+）/HAb18G 由本室构建，内含HAb18G 的全长 cDNA 编码序列;PCI-neo 真核表达质粒购自 Promega 公司;宿主菌大肠杆菌 JM109 及肝癌细胞株 HHCC 由本室常规保存;Lipfectinamine2000 脂质体转染试剂盒购自 Gibco 公司，质粒提取试剂盒、G418 购自 Promega 公司，限制性内切酶，T4 连接酶购自宝泰克公司;凝胶纯化试剂盒购自 Clontech 公司;抗人肝癌的鼠单克隆抗体 HAb18 由本室制
8、备;免疫组化 SP 染色试剂盒购自福州迈新公司. 1.2 方法 1.2.1 DNA 操作与克隆 DNA 操作包括感受态菌株的制备，质粒的扩增、提取，限制性酶切，琼脂糖凝胶电泳分离均参照文献6进行，PCI-neo 及 pBlue-script ks（+）/HAb18G 质粒分别经 Xba及 Xho双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，以凝胶纯化试剂盒纯化相应的 DNA 片段.用T4 噬菌体 DNA 连接酶将 1.7kb 左右 HAb18G cDNA 全长序列反向连接到PCI-neo 真核表达质粒的 Xho-Xba间，构建成 PCI-asHAb18G 反义 RNA表达载体，转化感受态细菌 JM109，随机挑
9、选氨苄抗性的转化克隆，限制性内切酶酶切鉴定. 1.2.2 插入片段部分序列的分析 以 T3 启动子序列为测序引物，直接以构建的 PCI-asHAb18G 反义 RNA 表达载体为模板，用全自动荧光 DNA序列分析仪进行单向 DNA 序列分析. 1.2.3 反义 RNA 抑制 HAb18G 表达 用阳离子脂质体Lipfectinamine2000 介导将空质粒表载体 PCI-neo 及重组质粒 PCI-asHAb18G 转染至人肝癌细胞 HHCC，分别命名为 HHCC/neo 和HHCC/asHAb18G，并以 HHCC 作为阴性对照.具体操作步骤参照说明书及文献7进行.转染第 2 日将细胞以
10、16 的稀释比例传代培养，2d 后用含400mgLG418 的选择培养液连续培养 4wk，每周换液 2 次，用有限稀释法挑选单个抗性细胞在 G418（100mgL-1 ）下常规培养扩增. 1.2.4 转染细胞的免疫组织化学染色 取经转染的细胞爬片，经冷丙酮固定，进行 SP（链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶）法染色， （具体操作步骤参照说明书） ，以抗 HAb18G 的 mAbHAb18 为一抗，生物素标记的羊抗鼠 Fc 段特异性 IgGmAb 为二抗，与链霉素抗生物素蛋白过氧化酶及作用底物（DAB）混合进行间接免疫组织化学染色，显微镜下观察结果并照相.以空载体转染的细胞设立对照. 1.2.5 转染
11、细胞的流式细胞仪分析 收集转染后 G418 筛选获得的HHCC 细胞单个克隆进行间接免疫荧光染色.将 1105 细胞吹打成单细胞悬液，加入一抗 HAb18 及荧光素标记的二抗，固定，用流式细胞仪检测分析. 2 结果 2.1 HAb18G 反义 RNA 表达 质粒的构建及酶切鉴定 HAb18G 反义载体经 Xho和 Xba酶切后得到 1.7kb 左右人 HAb18GcDNA 及 5.5kb 左右两 个片段.用 Sma酶切（质粒多克隆酶切位点及 HAb18GcDNA1.1kb 左右各有一酶切位点）得到两个片段，大小分别为 1.1kb 左右及 6.1kb（Fig1）.酶切结果证明载体构建成功，经测序
12、更进一步得以证实（Fig2） ，将其命名为 PCI-asHAb18G. 图 1 图 2 略 2.2 免疫组化染色 结果显示 HHCC 反义转染株 HHCC/asHAb18G 为阴性染色（Fig3） ，而 HHCC 空载体转染株 HHCC/neo 与 HHCC 均为强阳性染色（Fig4）. 2.3 流式细胞仪结果 反义载体转染株 HHCC/asHAb18G 细胞荧光强度低，平均荧光强度为 5，HHCC 空载体转染株 HHCC/neo 与 HHCC 大体相同，平均荧光强度为 500（Fig5）. 3 讨论 CD147 分子是广泛表达于造血及非造血细胞系，Mr5000-6000 的跨膜糖蛋白，属免疫
13、球蛋白超家族（IgSF）成员.编码 CD147 的基因定位于人19 号染色体 19p13.3，人 CD147 分子曾有多种不同的命名，包括TCSF/EMMPrin，M6，Basigin，Neurothe-lin.如此多的命名也反映其在不同的组织中有不同的功能.在人肝癌组织中发现 CD147 分子，目前尚无报道，因此其在肝癌组织的功能也值得去研究.我们曾经用表达HAb18G（CD147）的 CHO 细胞刺激人成纤维细胞，证实成纤维细胞分泌MMPs 的量大大增加8 ，即其具有 EMMPrin 的功能.EMMPrin 最初源于人肺癌细胞系 LX-1，属免疫球蛋白超家族（IgSF）成员，能够结合于内皮
14、细胞及纤维母细胞9 ，因纯化的该蛋白可刺激人成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶（MMPs）而得名. 图 3 图 5 略 恶性肿瘤的转移虽然极其复杂，但在其侵袭、转移演进过程中，癌细胞必须首先具备降解细胞外结缔组织间质和血管基底膜这些天然屏障的能力，这依赖于蛋白水解酶的作用.蛋白水解酶主要包括 4 类，即:丝氨酸蛋白酶（如纤溶酶原激活物 PAs） 、半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶B）以及天门冬氨酸蛋白酶（如胃蛋白酶）和基质金属蛋白酶 MMPs，其中基质金属蛋白酶最为重要.大量研究已表明，恶性肿瘤组织中 MMPs 的含量及活性显著高于其周围正常组织，且与肿瘤恶性表型密切正相关10 ，因而是肿瘤具备高转移潜
15、能的一个客观、良好的分子指标，已逐渐成为近年来肿瘤侵袭、转移研究的热点.MMPs 在肿瘤转移中的作用可概括为:破坏局部组织结构，促进肿瘤生长;破坏基底膜屏障，利于肿瘤转移;通过对细胞外基质的改建，促进肿瘤新生血管的形成.为此，我们构建了 HAb18G 反义 RNA 质粒，用反义 RNA 特异封闭肿瘤细胞的mRNA，封闭肝癌细胞表面 HAb18G/CD147 的表达，从而抑制人成纤维细胞分泌 MMPs，进而抑制肝癌细胞的侵袭.实验结果表明，当 PCI-asHAb18G转染肝癌细胞后，转染细胞的免疫组化染色强度明显降低，流式细胞仪证实其膜表面荧光强度减弱.这些变化主要是由于反义 RNA 与 HAb
16、18GmRNA结合，阻碍了其翻译过程，封闭了 HAb18G 分子的表达.上述结果提示，用 HAb18G 反义 RNA 阻断其表达，有可能降低其刺激成纤维细胞产生 MMPs的能力，进而可以抑制肝癌细胞的侵袭能力，改变肿瘤细胞的生物学行为.合理地利用反义技术以改变和抑制肿瘤细胞的恶性行为，是肿瘤基因治疗的一个方向. 参考文献: 1Qui K，Chen ZN，Liu ZG.Manufacture of human hepatoma an- tibody F（ab ）2and single fragment of Fab by pawpaw proteinase J.Di-si Junyi Daxue
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