1、真核细胞主要的细胞器及细胞骨架,第二部分,内容提要,线粒体、叶绿体细胞内膜系统： 内质网、高尔基体、溶酶体等细胞核细胞骨架,一、线粒体和叶绿体,都是能量转换器，高效生成ATP。双层膜结构，其中内膜在能量转换中起主要作用。都具有环状DNA以及自身的转录、翻译体系。,（一）形态、结构和分布,线粒体的大小和数量反映了细胞的能量需求,图：细胞内线粒体和微管分布的关系,至少在酵母和培养的哺乳动物细胞中，线粒体不是以分散的、单个形式存在，是形成高度分支的、相互连接的网络结构。,（a）相差显微镜下的成纤维细胞，可见线粒体是深色的小体，呈现出网状结构。（b）线粒体纵向切片的透射电镜显微照片，展示内部结构，尤
2、其是内膜折叠形成嵴。（c）线粒体定位在精子的中段，它们围绕着鞭毛的近轴部分。精子运动所需的ATP由这些线粒体提供。,线粒体的结构（a）浸软的线粒体的扫描电镜照片，显示被线粒体内膜折叠所围绕的内部基质。（b）线粒体的三维重建结构图在重建图中，外围的线粒体内膜以蓝色表示，而穿入基质形成嵴的内膜则用黄色表示。（c）线粒体的内部结构模式图,线粒体的分布,除了成熟的红细胞，线粒体普遍存在于真核细胞在多数细胞中，线粒体均匀分布在整个细胞质中，但在某些些细胞中，线粒体的分布是不均一的，有时线粒体聚集在细胞质的边缘。在细胞质中，线粒体常常集中在代谢活跃的区域，因为这些区域需要较多的ATP，如肌细胞中有很多线粒
3、体。另外，在精细胞、鞭毛、纤毛和肾小管细胞的基部都是线粒体分布较多的地方。线粒体除了较多分布在需要ATP的区域外，也较为集中的分布在有较多氧化反应底物的区域，如脂肪滴，因为脂肪滴中有许多要被氧化的脂肪。,在光照下合成叶绿素，前质体发育成叶绿体。,基质类囊体 又称基质片层，伸展在基质中彼此不重叠； 基粒类囊体 或称基粒片层，可自身或与基质类囊体重叠，组成基粒。,菠菜叶绿体切片的电镜照片示类囊体,（二）线粒体和叶绿体是半自主性细胞器,细胞器DNA的大小类似病毒DNA。,线粒体和叶绿体具有自身的遗传系统,mtDNA编码的基因包括 rRNAs, tRNAs和一些线粒体蛋白。,The organizat
4、ion of the liverwort(地钱) Chl genome,线粒体和叶绿体对核遗传系统的依赖,参与构成线粒体和叶绿体的蛋白都有上千种，而这两种细胞器DNA编码并在细胞器内部合成的蛋白数量和种类非常有限。绝大部分的蛋白质是由核基因编码的，在细胞质核糖体上合成后，再转运到细胞器中。线粒体和叶绿体的生长和增殖受到核基因组和自身基因组两套遗传系统的控制，前者的作用更为重要。,线粒体膜上的三种蛋白转运通道,TOM, TIM和 OXA 复合物是多亚基的膜蛋白，负责催化蛋白的跨线粒体膜的转运。TOM分布在线粒体的外膜，负责蛋白跨越外膜。TIM (TIM23 和 TIM22)分布在内膜上，负责蛋白
5、跨越内膜。OXA分布在内膜上， 负责将在线粒体内合成的蛋白插入到内膜上，也帮助TOM和TIM将一些蛋白送至线粒体基质中。,蛋白质向线粒体的转运,蛋白质N-端的信号序列被TOM的受体识别，蛋白在特定的位点跨越线粒体的两层膜。,线粒体前体蛋白在胞质中合成后，通过与胞质中的hsp70分子伴侣的相互作用保持未折叠的状态。,ATP水解和H+ 梯度驱动了蛋白运输到线粒体中。,运输到内膜和膜间隙的蛋白要求2个信号序列。,2个信号序列指导蛋白定位到类囊体的膜上。,Translocation into thylakoid space or thylakoid M can occur by any one of
6、at least four routes.,（三）、线粒体和叶绿体的增殖和起源,细胞器的生长和分裂决定了细胞中线粒体和质体的数量。,Mit fission and fusion (a dividing Mit in a liver cell); Dividing or Budding of Mit. Chloroplasts: dividing and formation of chloroplasts from proplastids begins by the light-induced budding of the inner membrane.,线粒体和叶绿体的起源,通过比对多种细菌的
7、rRNA序列，推测：线粒体是由紫细菌进化而来；叶绿体是由蓝细菌进化而来。,线粒体和过氧化物酶体有一些共同特征：两者都是通过预先存在的细胞器分裂而增殖的；两者都从细胞质基质中输入预生成的蛋白质；两者都能进行类似的氧化代谢。在一些哺乳动物中已经发现它们都存在一种酶丙氨酸/乙醛酸氨基转移酶。,过氧化物酶体,通过蔗糖密度梯度离心分离到的纯化的过氧化物酶体的电镜照片，内部通常含有致密的氧化酶晶体核心。 过氧化物酶体是过氧化氢（H2O2）合成和降解的场 所，通过两步反应催化。,过氧化物酶体（也称微体）是一种多功能细胞器，含有50多种酶。这些酶涉及各种不同的活性。过氧化物酶体也存在于植物中，植物幼苗中含有一
8、种独特的过氧化物酶体乙醛酸循环体。植物幼苗依靠储存的脂肪酸提供能量和原料，以形成新的植株。,植物幼苗中的乙醛酸循环体的定位（通过对过氧化氢酶的细胞化学染色而显现）。棉花种子中子叶切片的光镜照片。,由线粒体或过氧化物酶体功能异常 引起的疾病,线粒体病可由核基因缺陷或线粒体基因缺陷造成，因此这类疾病可有多种遗传模式，如母系遗传、孟德尔遗传，或者两者均有。 更多的线粒体病是由线粒体DNA(mtDNA)的突变引起的。线粒体DNA没有防止损伤的DNA修复系统，容易受到高水平的致突变的氧自由基的影响。如：帕金森病（PD）。,许多遗传病的特征是单一的过氧化物酶缺乏，如：肾上腺脑白质病变（ALD）。此病是由于
9、缺乏一种膜转运蛋白，致使不能将极长链脂肪酸（VLCFA）转运到过氧化物酶体中进行正常代谢。由于缺乏这种膜转运蛋白，VLCFA在脑部中积累并破坏髓鞘，引起肾上腺机能不全和神经功能异常。,二、细胞内膜系统,指在结构、功能乃至发生上相互关联、有膜包被的细胞器或细胞结构主要包括内质网、高尔基体、溶酶体、胞内体和分泌泡。细胞质中其他几个膜性细胞器线粒体、过氧化物酶体和叶绿体不是内膜系统的部分。,合成、分泌和内吞途径将内膜系统统一为一个动态的网络,（一）、研究细胞内膜系统的技术,1 放射自显影技术：通过标记大分子的前体来示踪大分子代谢的过程，分析它们不同时 期在不同组织、细胞或细胞器中被摄取、转运、贮存及
10、排出的动态变化，从而在不破坏组织和细胞结构的情况下了解细胞、组织和器官的代谢状态 。,2.绿色荧光蛋白的应用 将编码GFP的DNA与编码所研究蛋白的DNA融合，得到的嵌合DNA 导入能在显微镜下观察的细胞。嵌合DNA一旦进入细胞，所表达的嵌合蛋白含有融合于所研究蛋白末端的GFP。,3.亚细胞组分的生化分析,细胞匀浆后获得的微粒体可以看做内质网的模型,4.遗传突变体的研究筛选细胞质膜上蛋白质表现出异常分布的酵母突变体细胞，研究蛋白合成后的转运。,（二）、内质网,1 类型和分布：粗面内质网（ rER） 多由板层状排列的扁平囊构成； 在分泌蛋白质旺盛及大量合成膜的细胞中丰富，而在未分化或者分化程度低
11、的细胞中含量少。光面内质网（sER） 多为管状或泡状，在合成类固醇激素、脂类代谢旺盛的细胞中含量丰富。,2 内质网的功能,（1）粗面内质网的功能 主要功能是进行外输性蛋白质的合成、修饰加工、分选和转运。主要合成的蛋白质包括分泌性蛋白、膜整合蛋白、可溶性驻留蛋白。,一些蛋白是在刚起始合成不久转移到内质网膜上，继续蛋白的合成。在rER上，多肽链边合成边进入内质网腔，主要是： 分泌蛋白 膜整合蛋白 内膜系统细胞器中的可溶性驻留蛋白： 这类蛋白需要和其他细胞组分严格隔离，或者合成后需要进行修饰和加工。,在 “游离”核糖体上合成的蛋白,细胞质基质中的驻留蛋白 质膜外周蛋白 核输入蛋白 转运到线粒体、叶绿
12、体和过氧物酶体的蛋白,（2） sER的主要功能是脂类合成的重要场所。合成细胞所需的几乎全部的膜脂。 包括磷脂和胆固醇，其中最主要的是磷脂酰胆碱（卵磷脂）。在内质网膜上合成的磷脂迅速转向内质网腔面，可能和磷脂转位因子（转位酶）有关。磷脂的转运方式：出芽或磷脂转换蛋白（PEP）的协助,（）在rER腔内进行蛋白质的修饰和加工。 进入内质网中的蛋白质发生的主要化学修饰有糖基化、羟基化、酰基化和二硫键的形成。,糖基化伴随多肽的合成同时进行，是最为常见的修饰方式，发生在内质网腔面。糖基化是在糖基转移酶的催化下，由磷酸多萜醇将寡糖基转移到有关的氨基酸上。,糖基化的方式：(1) N-连接的糖基化（内质网中）N
13、-乙酰葡萄糖胺寡糖基转移到Asn残基上(2) O-连接的糖基化（主要在高尔基体中）N-乙酰半乳糖胺寡糖基转移到Ser, Thr残基或者Hylys/Hypro上。,（）新生多肽的折叠和组装蛋白质在内质网中的停留时间很大程度上取决于蛋白正确折叠所需的时间。畸形肽链或未装配的蛋白亚基，一般不能进入高尔基体中，在被识别后，通过转位子Sec61p复合体从内质网腔转至细胞质基质，被蛋白酶体降解。,内质网膜腔面上有蛋白二硫键异构酶，帮助和促进蛋白正确折叠。内质网中有结合蛋白（binding protein, Bip， chaperone ），属于Hsp70家族的成员，可以识别异常折叠的或未装配好的蛋白亚基，
14、并促进它们重新的折叠和装配。,蛋白N-连接的糖基化与新生蛋白的质量控制,质量控制可以保证错误折叠的蛋白不会离开内质网,内质网腔中含有：Bip 和calnexin (分子伴侣) : 识别并结合未折叠的或者错误折叠的蛋白，使其恢复正确构象。蛋白二硫键异构酶 ( PDI ) ;糖基转移酶（GT）：识别未折叠或错误折叠的蛋白，为寡糖链末端添加一个葡萄糖。,蛋白二硫键异构酶和Bip蛋白都含有4肽信号，保证它们滞留在内质网中，并维持较高的浓度。 Lys-Asp-Glu-Leu-COO- (KDEL) His-Asp-Glu-Leu-COO- (HDEL),内质网的其他功能,sER具有解毒的功能，如肝细胞的
15、sER中含有一些酶，可以清除脂溶性的废物和代谢产生的有害物质。含合成制造胆固醇并进一步产生固醇类激素的一系列酶，如睾丸间质细胞。具有储存Ca2+的功能，如在肌质网膜上存在Ca2+-ATP酶，将泵入腔中。存在IP3受体，可能和信息传递有关。为细胞质基质中多种蛋白提供附着位点。,（三）高尔基体,是细胞内大分子运输的一个主要的交通枢纽以及细胞内糖类合成的工厂。,高尔基体和细胞分泌活动,除了分泌蛋白外，多种膜蛋白、溶酶体中酸性水解酶、胶原纤维等胞外基质成分通过高尔基体完成定向转运。蛋白质在高尔基体中分选及其转运的信息仅存在于编码这个蛋白质的基因的本身。,溶酶体酶的分选,溶酶体酶具有一个共同的标志：-磷
16、酸甘露糖（M6P),通过和高尔基体反面囊膜上结合的M6P受体的作用，使溶酶体的酶和其他蛋白质分离并起到了局部浓缩的作用。,M6P作为溶酶体酶分选标记的发现,I-cell disease(I细胞疾病)是一种罕见致命的遗传病，患者的许多细胞的溶酶体充满了未被降解的物质。,将患者的成纤维细胞体外培养研究，发现 溶酶体酶的合成水平正常，但是分泌到培养基中，而非靶向到溶酶体中。分泌的酶缺少正常细胞中这些酶具有的M6P残基。,催化M6P生成的酶N-乙酰葡萄糖胺磷酸转移酶缺失,糖链在多数蛋白质的分选中并不起决定性的作用,在肝细胞中溶酶体酶还存在不依赖于M6P的另一种分选途径。,蛋白质的糖基化及其修饰,rER
17、上合成的大多数蛋白质在内质网和高尔基体中发生了糖基化，在从内质网到高尔基体以及各膜囊之间的转运过程中，连接在蛋白侧链上的寡糖基会发生一系列有序的加工和修饰。,糖基化及其意义,糖蛋白中的寡糖链的合成和加工没有模板，依靠不同的酶在不同的间隔中经历复杂的加工过程完成。糖基化有利于高尔基体的分类和包装，保证了糖蛋白的单向运输，对多数分选的蛋白质来说，糖基化不是蛋白分选的信号。 糖基化的主要作用是使蛋白质在成熟过程中折叠成正确的构象，并增加蛋白质的稳定性。,蛋白质糖基化类型,Glycosylation in the Golgi complex,Golgi complex plays a key role
18、 in the assembly of the carbohydrate component of glycoproteins and glycolipids.,The core carbohydrate of N-linked oligosaccharides is assembled in the rER. Modifications to N-linked oligosaccharides are completed in the Golgi complex. O-linked oligosaccharides takes place in Golgi complex.,蛋白酶的水解和其
19、他加工过程,一些多肽在rER中切除信号肽后成为有活性的成熟多肽，如一些生长因子。一些多肽在高尔基体中，在TGN膜结合的蛋白水解酶的作用下，特异水解成有生物活性的多肽。,（四） 溶酶体,1 形态结构与类型,几乎存在于所有的动物细胞中。溶酶体是单层膜围绕、内含多种酸性水解酶类的囊泡状细胞器。主要功能是进行细胞内的消化作用。,小鼠脾脏巨噬细胞中的溶酶体用电镜细胞化学技术显示其中含有的酸性磷酸酶，M：线粒体，L：溶酶体,溶酶体膜的特征,嵌有质子泵，形成和维持溶酶体中酸性的内环境 。,具有多种载体蛋白用于水解的产物向外转运；,膜蛋白高度糖基化，可能有利于防止自身膜蛋白的降解。,2 溶酶体类型,()初级溶
20、酶体（primary lysosome） ()次级溶酶体（secondary lysosome）是初级溶酶体和细胞内的吞噬泡、胞饮泡融合形成的复合体，是进行消化作用的溶酶体。分为： 自噬溶酶体（autophagolysosome）异噬溶酶体（phagolysosome）,（）残余小体（residual body），又称后溶酶体。 是未被消化的物质残存在溶酶体中形成的结构。通过胞吐方式将内容物排出。,Lysosome is a heterogenous(异质性) organelle,Primary lysosomesSecond lysosomes heterophagic autophagic
21、Residual body,Primary Lys.,Second Lys,Marker enzyme (标志酶):acid phosphatase,3 溶酶体的功能,（1）清除无用的生物大分子、衰老的细胞器及衰老损伤和死亡的细胞。 真核细胞通过溶酶体，以降解方式清除暂时不需要的酶或代谢产物。,溶酶体和蛋白酶体共同清除衰老的细胞器和生物大分子，以及凋亡的细胞。,（）防御功能是某些细胞特有的功能，如：病原体感染刺激单核细胞分化成巨噬细胞，其中富含溶酶体，以及H2O2、O2-,共同作用杀死细菌。,作为细胞内的消化“器官”为细胞提供营养；,（）其它重要的生理功能,分泌腺细胞中，溶酶体摄入分泌颗粒参与
22、分泌过程的调节；,参与清除赘生组织或退行性变化的细胞；,受精过程中的精子的顶体反应。,依赖于M6P的分选途径的效率不高，部分溶酶体酶通过运输小泡直接分泌到细胞外。还存在不依赖于M6P的分选途径。,溶酶体的发生途径多样化,溶酶体酶的合成及N-连接的糖基化修饰(rER),高尔基体cis膜囊寡糖链上的甘露糖残基磷酸化,M6P,N-乙酰葡萄糖胺磷酸转移酶,高尔基体TGN膜（M6P受体）,溶酶体酶分选与局部浓缩,以出芽的方式转运到前溶酶体,磷酸葡萄糖苷酶,磷酸化识别信号：信号斑,溶酶体发生途径,（五）细胞内蛋白质的分选,1 蛋白质的合成：线粒体合成少量蛋白质叶绿体细胞质基质中核糖体：绝大多数蛋白合成起始
23、于此，通过定向运输(targetting)或分选到细胞的特定部位。,真核细胞蛋白质的定向运输与信号信号有关，这些信号序列或者位于蛋白的N端，或者位于C端，或者在蛋白序列的内部，是由一些特定的氨基酸组成的。不同的信号序列会被特定的受体识别，从而引导蛋白质在细胞内正确的定位。,2. 蛋白质的分选（protein sorting）,不含有分选信号的蛋白质，将保留在细胞质中，包括翻译机器、细胞骨架、代谢相关的酶、多种信号转导分子等。,蛋白分选的信号序列也可以是一级结构上不连续的一些片段，在蛋白质折叠形成空间构象时，彼此靠近，形成的信号称为信号斑。,（1）分泌蛋白的分选机制信号假说和共转运 GBlobe
24、l，1999, Nobel Prize 分泌蛋白的N端序列作为信号肽，指导分泌性蛋白到内质网膜上合成，蛋白边合成边通过易位子进入内质网腔，在蛋白合成结束之前，信号肽被切除。,信号假说涉及的相关成分：信号肽：位于蛋白质N-端，一般有1626个氨基酸，似乎专一性不强。信号识别颗粒(SRP）：是RNP复合物，可以结合信号肽、核糖体和停泊蛋白。信号识别颗粒的受体（或停泊蛋白，DP）：存在于内质网上，特异地结合SRP。,实验证据：非细胞系统中蛋白质翻译过程与SRP、DP和微粒体,* “+”和“-”分别代表反应混合物中存在（+）或不存在（-）该物质。,分泌性蛋白的合成,分泌蛋白、整合膜蛋白、可溶性驻留蛋白
25、是以共转运的方式分选的。,线粒体、叶绿体、过氧化物酶体中绝大多数蛋白的合成和转运方式，蛋白质在细胞质基质中合成以后再转移到这些细胞器中。蛋白的N端具有导肽，被相应细胞器膜上受体识别，在完成引导蛋白正确定位后被切除。后转运中，蛋白质跨膜转移过程需要ATP使多肽去折叠，还需要一些蛋白质的帮助（如热休克蛋白Hsp70）使其能够正确地折叠成有功能的蛋白。,（2）后转运：,蛋白分选的基本途径：共转运：分泌蛋白、细胞膜、溶酶体、内质网、高尔基体蛋白后转运：主要是线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、细胞核、细胞质基质定位的蛋白,3 蛋白分选的类型,（1） 跨膜运输（transmembrane transport）
26、 主要指在细胞质基质中合成的蛋白质转运到内质网、线粒体、质体、过氧化物酶体等细胞器。,有信号序列的引导；以单链或去折叠的形式穿过细胞器膜上的通道；有分子伴侣协助完成；,（2） 膜泡运输（vesicular transport）蛋白质通过不同类型的转运小泡从rER转运到高尔基体，进而分选到细胞的不同部位。,以出芽方式形成膜泡，包裹蛋白进行运输，膜泡最终和靶膜融合，将蛋白运送到特定位置；有三种不同的膜泡分别进行运送；只运送正确折叠和组装好的蛋白质；在转运过程中，被转运蛋白或脂类物质的方向不发生变化。,和膜泡运输有关的有被小泡： 网格蛋白有被小泡： 负责蛋白质从高尔基体TGN向质膜、胞内体或 溶酶体和植物液泡的运输； 受体介导的内吞途径 COPI有被小泡： 负责回收、转运内质网逃逸蛋白。 COPII有被小泡： 负责从内质网向高尔基体的物质运输。,（3） 门控运输（gated transport）指在细胞质基质中合成的蛋白质通过核孔复合体选择性地从细胞核进出。,通过核孔的运输；蛋白含有核定位信号；运送的是已经折叠或组装好的蛋白。,（4） 细胞质基质中的蛋白质转运与细胞骨架关系密切，机理尚不清楚。,
