1、肺癌相关蛋白的筛选与鉴定【摘要】 目的： 应用蛋白质组学方法筛选肺癌相关蛋白，为阐明肺癌发生的分子机制和预后研究提供理论依据. 方法： 收集 8 例手术切除的新鲜肺癌组织及同一患者手术切缘的癌旁组织，提取可溶性总蛋白. 应用等电聚焦（IEF）电泳和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰凝胶电泳（SDSPAGE ）技术将可溶性总蛋白分离，得到肺癌的蛋白质组分析型双向电泳图谱，经 PDQuest 凝胶图像分析软件分析后找出差异蛋白点. 胶内酶解差异表达的蛋白点，基质辅助电离解析飞行时间质谱（MALDITOFMS ）获得肽质量指纹图谱(PMF)，搜寻蛋白质数据库，并运用生物信息学鉴定蛋白质，分析蛋白的生物学意义和生
2、物学功能，作为肺癌标志物的候选蛋白. 结果： 分别将 8 例肺癌组织及配对的癌旁组织可溶性总蛋白经过重复 3 次双向电泳，建立了肺癌组织蛋白质表达谱. 经 PDQuest 凝胶图像分析软件进行分析后， 12 个蛋白质斑点只在肺癌组织有表达；6 个蛋白质斑点只在癌旁表达. 对高丰度的肺癌特异表达的蛋白点进行鉴定，结果表明这些特异蛋白分别为钙粒蛋白 B,Calgizzarin,载脂蛋白 AI, 载脂蛋白 E,Ras 相关蛋白 Rab14, 亲环素. 结论： 建立了人肺癌组织和癌旁组织的双向电泳图谱，为建立相应的蛋白质数据库提供了基础数据；鉴定了钙粒蛋白 B 等肺癌相关蛋白质，为进一步寻找肺癌蛋白标
3、志物奠定了基础，对阐明肺癌发生的分子机制和预后研究有重要理论意义. 【关键词】 肺肿瘤 相关蛋白 蛋白质组学 双向凝胶电泳 基质辅助激光解析电离质谱 0 引言 肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一1, 它的发生、增殖、侵袭是多因素参与、多步骤完成的，伴随着复杂的基因和蛋白质表达模式的改变2-3. 寻找疾病发生发展过程中起关键作用的蛋白质分子,用于肺癌的早期诊断及预后评估一直是研究的热点和难点，蛋白质组学为研究这一现象提供了强有力的工具4. 我们应用蛋白质组学研究技术对肺癌组织与配对的癌旁组织的蛋白质组进行研究, 筛选肺癌相关蛋白，探索肺癌相关蛋白特征，以对肺癌的早期预警和预后提供科学依据. 1
4、 材料和方法 1.1 材料 手术切除的新鲜肺癌组织 8 例及同一患者手术切缘的癌旁组织，取自郑州大学第一附属医院，标本均经过病理学鉴定为肺腺癌. IPG 预制胶条（pH 310, 7 cm, 17 cm）, 3/10 Ampholyte,尿素,硫脲,TBP（三丁基膦）,DTT（二硫苏糖醇）,PMSF（苯甲磺酰氟）购自美国 BioRad 公司；三氟乙酸、乙腈、碘乙酰铵购自 Sigma 公司. 双向电泳系统（IPGphor 等电聚焦仪、PROTEAN xi cell 电泳仪、GS800 图像获取仪、PDQuest 7.1 凝胶图像分析软件）为美国 BioRad 公司产品. 1.2 方法 1.2.1
5、 固相 pH 梯度双向凝胶电泳提取组织可溶性总蛋白，定量后进行双向电泳. 第 1 向等电聚焦电泳程序如下： 50 V 主动水化，16 h（17） ；250 V 除盐， 30 min；1000 V 除盐 1 h；升压 5 h 至 1104 V，聚焦至 8104 Vh；第 2 向 SDSPAGE 电泳条件如下：压缩电流（5 mA/gel/17 cm） ，分离电流（30 mA/gel/17 cm）. 1.2.2 双向电泳图谱分析利用 PDQuest 软件内部支持的图像扫描装置GS800 获取图像. 1.2.3 胶内酶解及 MALDITOFMS 鉴定将扫描分析后的胶置于明亮的灯光下用硅烷化的枪头切取蛋
6、白点，用 2mg/L 胰蛋白酶胶内酶解蛋白，得到的样品由上海基康生物技术有限公司协助完成 MALDITOFMS 鉴定，获得检测样品的肽质量指纹图谱. 1.2.4 数据库检索根据各肽段的 m/z 数据，利用Mascot（http:/prospector.ucsf.edu/）和 Profound (http:/129.85.19.192/profoundbin/WebProFound.exe) 软件，设置适当的搜索参数，在 NCBInr，Swissprot 蛋白数据库中搜索理论上酶解肽段能与之相匹配的蛋白，根据搜索结果并结合蛋白质在胶上的等电点和分子质量最终确定蛋白质. 2 结果 2.1 肺癌组织
7、和癌旁组织蛋白质表达 图谱的建立经过双向电泳，获得了重复性较好的肺癌与癌旁组织的双向凝胶电泳银染图谱(图 1). 其平均蛋白质点数依次为 55512 和54010. 2.2 肺癌组织和癌旁组织蛋白质表达图谱分析及差异表达 蛋白肺癌组织和癌旁组织的差异蛋白表达谱表明，有 12 个点在癌组织中表达，在癌旁组织中未检测出；6 个点在癌旁组织中表达，在癌组织中未检测出，其中见部分蛋白质斑点的放大图谱(图 2). 对肺癌组织特异表达且丰度高的 12 个蛋白斑点进行质谱鉴定，获得蛋白的酶解片段肽质量指纹图谱（图 3）. 用 Mascot 或 Profound 软件搜索蛋白数据库，获得对应的蛋白质（表 1）
8、 ，经检索鉴定出肺癌特异表达的蛋白质（图 4）.表1 蛋白质点肽质量指纹谱检索 SWISSPROT 数据库结果（略） 3 讨论 我们利用 2DE 系统建立了肺癌组织和癌旁组织可溶性总蛋白差异表达图谱，结果显示 2DE 系统具有良好的重复性，这为寻找差异表达蛋白提供了基础. 比较分析人肺癌组织和配对癌旁组织的蛋白质组表达谱，并选择 12 个肺癌组织特异表达的蛋白点进行分析，获得其肽质量指纹图谱并对其进行初步鉴定. 由于肽质量指纹图谱在鉴定蛋白质方面仍存在局限性，搜索数据库时有主观因素的存在. 所以在肺癌组织中特异表达的这 12 个蛋白质点中，6 个蛋白点得到满意的匹配结果，得到鉴定. 钙粒蛋白
9、B(S100A9)和 Calgizzarin(S100A11)是钙结合蛋白 S100家族成员，S100 蛋白家族的不同分子具有广泛的生物学活性，在细胞增值、分化、肌肉收缩、基因表达、分泌及细胞凋亡中发挥重要作用，其功能异常也可以导致不同的疾病5-7. 我们发现 S100A11 和 S100A9在肺癌组织中异常表达，说明两种蛋白都参与了肺癌的发生和发展过程，但具体机制还需要进一步的深入研究. 载脂蛋白构成并稳定脂蛋白的结构,参与脂蛋白与细胞表面脂蛋白受体的结合代谢过程. Apo AI 在参与肿瘤的发生发展的过程复杂，有助于人们对肿瘤研究8. 载脂蛋白 E是人体十几种载脂蛋白之一，具有明显而丰富的
10、多态性，一直以来都是脂代谢研究中的热点9. 亲环素 CyP 是一个功能相关的蛋白家族，具有肽基脯氨基顺反异构酶活性，能催化细胞内蛋白质的折迭、装配和运输，起分子伴侣的作用. 目前的研究表明 CyPA 参与了许多癌的发生和发展过程9-10. 这些特异表达的蛋白质，可能参与了肺癌细胞恶性生长、去分化和其他表型与生物学特征改变的调节与控制, 为这些蛋白作为肺癌相关抗原的后续研究提供依据. 【参考文献】 1董志伟，乔友林，李连弟，等. 中国癌症控制策略研究报告J. 中国肿瘤，2002,11(5):250-260. 2张百红，姜宁西，邢传平，等. 肺癌组织 Caspase3 的表达与细胞凋亡的关系J.
11、第四军医大学学报,2002,23(1):35-39. 3陈健，杨增，梁景仁，等. 非小细胞肺癌组织中 Kras 表达及其临床意义J.第四军医大学学报,2003,24(20):1854-1856. 4Lahm HW, Langen H. Mass spectrometry: for the identification of proteins separated by gelsJ. Electrophoresis, 2000,21(11): 2105-2114. 5Ruse M, Lambert A, Robinson N, et al. S100A7, S100A10, and S100A11
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