1、宫颈癌特异抗原 MN.CA9 的多糖蛋白表达载体的构建及鉴定【关键词】 宫颈癌 摘要 :目的 克隆宫颈癌 MN.CA9 抗原的多糖蛋白 cDNA，并构建表达载体。 方法 从宫颈癌 HeLa 细胞中提取总 RNA，RT-PCR 法扩增 MN.CA9抗原的多糖蛋白 cDNA，将其插入载体 pCA13，转化大肠杆菌 JM109，构建MN.CA9 抗原的多糖蛋白表达载体 pCA13-MN。酶切及测序鉴定。 结果 酶切及序列分析结果证明，目的基因成功克隆入载体。 结论 成功构建了 MN.CA9 多糖蛋白表达载体。 关键词 :宫颈癌;MN.CA9 抗原;多糖蛋白;基因克隆 Abstract:Objecti
2、ve To obtain the cDNA of proteoglycan protein of MN.CA9antigen of cervical cancer and construct the eukaryotic gene targeting vector pCA13-MN.Methods The total RNA was extracted from human cervical carcinoma cell line HeLa and the intact cDNA of proteoglycan protein was amplified by RT-PCR.The cDNA
3、was cloned into pCA13vector and transformed into E.coli JM109.Results The result of sequencingwas completely consistentwith the published sequence of the proteoglycan protein cDNA.Conclusion The proteoglycan protein cDNA of MN.CA9antigen in human cervical cancer has been successfully cloned for prep
4、aring the tumor vaccine of MN.CA9antigen. Key words:cervical cancer;MN.CA9antigen;proteoglycan protein;cDNA cloning 宫颈癌的发病率高居发展中国家女性恶性肿瘤的首位。放射治疗是宫颈癌主要治疗方法之一，但对于中、晚期患者疗效并不理想1 。近年来，基础研究表明宫颈癌基因治疗具有应用前景，与放疗联合使用可显著提高进展期宫颈癌局部控制率，特别是对放射耐受的肿瘤2 。针对肿瘤特异抗原蛋白或 DNA 的瘤苗，可以诱导肿瘤特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）对肿瘤的杀伤作用。宫颈癌抗原 MN.C
5、A9 的发现，使利用瘤苗治疗宫颈癌成为可能。为此，构建 MN.CA9 的多糖蛋白 cDNA 表达质粒，以期为制备 MN.CA9 瘤苗治疗宫颈癌奠定基础。 1 材料和方法 1.1 主要材料 RNA 提取试剂盒、RT-PCR 试剂盒、质粒提取试剂盒、内切酶 Xho、Hind及 T 4 DNA 连接酶购自 Promega 公司;人宫颈癌HeLa 细胞、大肠杆菌 JM109、质粒 pCA13 由徐州医学院郑骏年教授惠赠。1.2 总 RNA 提取 取 HeLa 细胞约 110 5 个，按试剂盒说明提取总RNA。总 RNA 沉淀溶于 100l 无核酶水中，-80保存。 1.3 RT-PCR 根据 GenB
6、ank 发表的 MN.CA9cD-NA 序列，设计引物，由 Invitrogen 公司合成。上游引物:5-ATCCCCAAGCTTGCCCCCGGATGCA-GGAG-3，引入 Hind酶切位点。下游引物:5-CCAC-CGCTCGAGTGAAGC-GGCCCGCGCAG-3，引入 Xho酶切位点。加入总 RNA20g 作为模板，上、下游引物至终浓度 1mol.L，用 Promega 公司的 RT-PCR 试剂盒进行反转录及 PCR 扩增。反应条件为:9430s，601min，682min，40 个循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。 1.4 cDNA 的克隆及扩增 PCR 扩增产物经
7、酚-氯仿抽提纯化，Hind和 Xho双酶切及低熔点琼脂糖凝胶电泳回收，酚-氯仿纯化。然后与经相同酶切后回收纯化的 pCA13 质粒室温连接 5h，将连接产物转化感受态大肠杆菌 JM109，氨苄青平板筛选，37培养过夜。挑取单克隆阳性菌落，LB 培养基中小量扩增，按 Promega 公司的试剂盒说明提取质粒，酶切鉴定。 1.5 序列分析 由上海基康生物技术有限公司进行测序。 2 结果 2.1 MN.CA9 多糖蛋白 RT-PCR 产物分析 将 RT-PCR 产物行琼脂糖凝胶电泳，可见一清晰 360bp 扩增条带（图 1） ，其大小与理论预期值一致。2.2 MN.CA9 多糖蛋白 cDNA 克隆酶
8、切鉴定 对阳性克隆提取质粒后行Hind和 Xho双酶切鉴定，可见约 6.9kb 的载体片段及 360bp 的插入片段（图 1） 。 2.3 MN.CA9 抗原多糖蛋白 cDNA 序列分析 对经酶切鉴定初步确认的阳性克隆测序。结果显示其序列与 GenBank 发表的宫颈癌 MN.CA9 抗原多糖蛋白 cDNA 序列完全一致（图 2） 。 图 1 RT-PCR 扩增产物和质粒限制性酶切电泳图（略） 1.pCA13-MN 质粒双限制性酶切;2.pCA13 质粒单限制性酶切;3.DNA Marker;4.RT-PCR 扩增产物 图 2 pCA13-MN 质粒测序图（略） 3 讨论 1990 年，Wol
9、ff 等3 首先报道用质粒 DNA 肌肉注射可使外源性基因在体内表达。随着研究的深入，发现该方式可有效诱导机体产生针对该 DNA 编码蛋白的特异性体液及细胞免疫应答，从此掀起了第 3 代疫苗即 DNA 疫苗研究的热潮4-5 。 MN.CA9 抗原是宫颈癌特异抗原，研究表明 90%以上的宫颈癌高表达MN.CA9 抗原，而正常的宫颈上皮不表达此抗原6 。MN.CA9 抗原是碳酸酐酶蛋白，是一种跨膜糖蛋白，由 459 个氨基酸构成，相对分子质量为 5410 3 或 5810 3 。其胞外区含有 377 个氨基酸（AA38414） ，分为碳酸酐酶区和蛋白多糖区 2 个部分7 。MN.CA9 蛋白多糖区
10、中的一些肽段可被淋巴细胞识别，诱导特异性免疫应答。如位于 254262 位点的氨基酸组成的肽段可被 CTL 识别8 ，位于 249268 位点的氨基酸肽段可被 CD4（+）T 细胞识别9 。因此，蛋白多糖区 cDNA 或其表达蛋白可作为抗原刺激树突状细胞形成针对宫颈癌的瘤苗。 本实验以 RT-PCR 法从人宫颈癌 HeLa 细胞中获取 MN.CA9 多糖蛋白cDNA，酶切后克隆到表达载体 pCA13 中，经酶切及测序证实克隆成功。本研究的成功除可直接利用此质粒构建瘤苗外，还为利用其表达的MN.CA9 多糖蛋白制备瘤苗奠定了基础。 感谢徐州医学院泌尿研究室郑骏年教授给予的大力帮助! 参考文献 :
11、 1 Greenlee RT，Murray T，Bolden S，et al.Cancer statistics，2000J.CA Cancer J Clin，2000，50（1）:7-33. 2 Hamada K，Sakaue M，Alemany R，et al.Adenovirus-mediated transfer of HPV16E6.E7antisense RNA to human cervical cancer cellsJ.Gynecol Oncol，1996，63（2）:219-227. 3 Wolff JA，Malone RW，Williams P，et al.Direct
12、gene transfer into mouse muscle in vivoJ.Science，1990，247（4949Pt1）:1465-1468. 4 Tang DC，DeVit M，Johnston SA.Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response J .Nature，1992，356（6365）:152-154. 5 Donnelly JJ，Ulmer JB， Shiver JW，et al.DNA vaccinesJ.Annu Rev Immunol，1997，15:617-64
13、8. 6 Liao SY，Brewer C，Zavada J，et al.Identification of the MN antigen as a diagnostic biomarker of cervical intraepithelial squamous and glandu-lar neoplasia and cervical carcinomas J.Am J Pathol，1994，145（3）:598-609. 7 Grabmaier K，Vissers JL，De Weijert MC，et al.Molecular cloning and immunogenicity o
14、f renal cell carcinoma-associated antigen G250J.Int J Cancer，2000，85（6）:865-870. 8 Vissers JL，De Vries IJ，Schreurs MW，et al.The renal cell carcinoma-associated antigen G250encodes a human leukocyte antigen（HLA）-A2.1-restricted epitope recognized by cytotoxic T lymphocytesJ.Cancer Res，1999，59（21）:5554-5559. 9 Vissers JL，De Vries IJ，Engelen LP，et al.Renal cell carcinoma-as-sociated antigen G250encodes a naturally processed epitope presented by human leukocyte antigen-DR molecules to CD4（+）T lympho-cytesJ.Int J Cancer，2002，100（4）:441-444.
