1、国人单个心房肌细胞的分离及活性鉴定作者：张荣庆 梁延春 周更须 程何祥 贾国良 蔡振杰 【关键词】 心肌 关键词: 心肌;细胞分离 0 引言 加拿大学者 Bustamante等1 于 1982年首次报道了人单个心房肌细胞的分离方法，以后许多外国学者采用改良的 Bustamante法成功分离人单个心房肌细胞2 .目前国内人单个心房肌细胞分离方法尚未见报道.我们参考国外单个人心房肌细胞的分离方法，经过改良，成功地分离出 100例患者的心房肌细胞，建立了适合我国人种的心房肌细胞的分离方法.本方法的建立，为直接研究我国人心房肌细胞在生理及病理情况下生物学特性的改变提供了物质基础，对于心房疾病（如心房纤
2、颤）发病机制和治疗方法的研究，可以在不用动物模型的条件下，在细胞乃至分子水平直接进行. 1 材料和方法 1.1 试剂和溶液的配制 2，3 胶原酶（日本 YAKULT公司） ，蛋白酶 XXIV（美国 Sigma公司， ）.无钙液（mmol L -1 ）:NaCl126，KCl5.4，MgCl2 1.0，NaH2 PO4 0.33，葡萄糖10.0，HEPES（Sigma 公司）10.0，用 NaOH调 pH至 7.4.细胞保护液（KB液，mmol L-1 ）:KCl20.0，KH2 PO4 10.0，葡萄糖 10.0，谷氨酸70.0，牛磺酸 10.0，EGTA（Sigma 公司）10.0，牛血清白
3、蛋白（美国Amerco）10g L-1 ，用 KOH调 pH至 7.4.有钙液（mmol L -1 ）:NaCl126，KCl5.4 ，MgCl2 0.8，CaCl21.0，NaH2 PO4 0.33，HEPES（Sigma 公司）10.0，葡萄糖 5.5，用 NaOH调 pH至 7.4.未注明试剂均为国产试剂. 1.2 标本采集 心房标本取材于行心外科手术患者的右心耳.用 10mL氧饱和的无钙液在 37保温下，于 510min 内运送到实验室. 1.3 单个人心房肌细胞的分离保存 标本在氧饱和无钙液中剪成1mm3 小块，用无钙液在 37磁力搅拌下洗涤 3次，每次 4min，洗除标本中的血液和
4、钙离子;在含有胶原酶（0.4g L-1 ） 、蛋白酶（0.18g L-1 ）的无钙液中消化 3045min 后，换成含有胶原酶（0.4g L-1 ）的无钙液进行第二步消化;2030min 后，将组织块在 KB液中轻轻吹打，使细胞松散脱离组织块;细胞悬液用 200目滤网过滤，分离出的单个人心房细胞用 KB液保存.整个实验过程温度始终保持在 37，并且在充氧、磁力搅拌（频率 4Hz）条件下完成. 图 1 图 4 略 1.4 复钙及显微镜观察 分离出的心房肌细胞，在 KB液中保存3060min 后，吹匀，经 200目滤网过滤，1000r min -1 离心 5min，弃上清，加有钙液 5mL吹匀后加
5、入培养皿中，于倒置显微镜下观察. 1.5 膜片钳技术记录钾电流 应用仪器为美国 AXON公司生产的Axopatch200B放大器，按参考文献4方法进行. 1.6 人心房肌细胞的活性鉴定5 用 4g L-1 的台盼蓝 1份、细胞悬液 9份进行染色，3min 后用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，算出活细胞百分比. 2 结果和讨论 采用两步酶消化分离法，分离出杆状、横纹清晰、细胞膜完整的具有典型特征的人心房肌细胞（图 1）.经 KB液保护 3060min，复钙后，显微镜下观察一些细胞有收缩，完全贴壁后收缩消失，形态无明显变化.膜片钳记录到钾电流（图 2）.在有钙液中保存 24h，细胞仍平滑、清洁度
6、好、细胞膜完整（图 3）.经台盼蓝染色，死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染（图 4） ，细胞成活率为 30%70%. 应用 Langendoff装置对小鼠、大鼠、豚鼠等主动脉逆行插管灌流的方法，可以获得心肌细胞6，7 ，但所获得的细胞多数为心室肌细胞，很难分离出心房肌细胞.对于心房肌整体及单个细胞在生理及病理情况下生物学特性及改变的研究，以往多靠动物模型来完成8，9 ，但动物心脏与人的心脏在大小、质量、生理学特性及病理学改变上存在差异，所以动物模型研究的良好结果不能直接推论到人体.直接在人的心房肌细胞上进行某些疾病（如心房纤颤）发病机制及治疗方法的研究，其结果是最可靠的.1982 年 Bustam
7、ante等1 首次报道了人单个心房肌细胞分离方法，以后许多国外学者采用改良的 Bustamante方法成功分离单个人心房肌细胞.这使得直接研究人的心房肌细胞成为现实.但国内人单个心房肌细胞分离方法的报道极少见2 .我们采用国外学者的分离方法，摸索分离国人单个人心房肌细胞，进行了 50余例，均未取得成功.以后反复试验，将胶原酶及蛋白酶的浓度调整至参考文献2分离方法的一半，并且把两步总消化时间从约 90min缩短至约 1h，成功地分离出100余例患者的心房肌细胞.经台盼蓝染色，细胞包膜完整，显微镜观察，细胞具有收缩功能，膜片钳试验证实了细胞的电生理活性.改良后所分离的细胞功能与国外文献报道无差异.
8、本方法的建立，为直接研究国人心房肌细胞在生理情况下的生物学特性及病理情况下生物学特状的改变提供了物质基础. 参考文献: 1Bustamante JO，Watanbe T，Murphy DA，McDonald.Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart J.Can Med Assoc，1982;126（7）:791-793. 2Escand D，Coulombe A，Danziger RS，Faivre JF，Deroubaix E，Coraboeuf E.Two types of transient
9、 outward currents in adult human atrial cells J.Am J Physiol，1987;252（1-2）:H142- H148. 3Feng JL，Wible B，Li GR，Li GR，Wang ZG，Nattel S.Anti-sense oligodeoxynucleotides directed against Kv1.5mRNA specifically inhibit ultrarapid delayed rectifier K+ current in cul-tured adult human atrial myocytes J.Cir
10、c Res，1997;80（4）:572-579. 4Xu WH，Li W，Wang XL.Characteristics of transient outward K+ current in human atrial cardiomyocytes J.Acta Pharmacol Sin，1998;19（5）:481-485. 5Situ ZQ.Xibao peiyang（Cell culture） M.Xian:Shijie Tushu Chubanshe（World Publishing Company） ，1996:181. 6Wolska BM，Solaro RJ.Method fo
11、r isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluoyimetry J.Am J Physiol，1996;271（3-2）:H1250-H1257. 7Sakai M，Danziger RS，Xiao RP.Contractile response of indi-vidual cardiac to norepinephrine declines with senescence J.Am J Physiol，1992;262（1-2）:H184-H192. 8Wiffels M
12、CEF，Kirchhof CJHJ，Dorland R，Allessie MA.Atri-al fibrillation begets atrial fibrillation:A study in awake chroni-cally instrumented goats J.Circulation，1995;92（7）:1954-1968. 9Y LX，F JL，Rania G，L GR，W ZG，Nattel S.Ionic remodel-ing underlying action potential changes in a canine model of atri-al fibrillation J.Circ Res，1997;81（4）:512-525.
