1、胡黄连对缺血再灌注脑组织胶质源神经营养因子的影响【摘要】 目的 观察缺血再灌注大鼠脑内胶质源神经营养因子（GDNF）及 GDNF mRNA的变化，探讨胡黄连对神经元的保护作用。方法 成年健康雄性 Wistar大鼠 36只，应用线栓法制作脑缺血再灌注模型，用胡黄连甲醇提取物灌胃治疗后，免疫组织化学染色法观察皮质、纹状体 GDNF蛋白表达，原位杂交方法观察其 mRNA表达。结果 模型组缺血侧皮质区于缺血再灌 1 d时 GDNF蛋白、GDNF mRNA表达至高峰，与假手术组比较差异有显著性（F=14.168、40.189，q=12.56516.847，P0.01） ，14 d降至基础水平；纹状体区于
2、缺血再灌 3 d时 GDNF蛋白、GDNF mRNA表达至高峰，与假手术组比较有显著性差异（F=12.531、113.312,q=11.37912.565,P0.01） ，14 d降至基础水平；胡黄连组缺血再灌注 14、21 d时 GDNF蛋白、GDNF mRNA表达与手术组及假手术组比较升高，有显著性差异（q=16.84730.079，P0.01)。结论 胡黄连对脑缺血再灌注损伤神经元有保护作用，其机制可能与上调脑内 GDNF表达有关。 【关键词】 胡黄连 脑缺血再灌注 胶质源性神经营养因子 大鼠 Wistar ABSTRACT Objective To observe the expres
3、sion of glial derived neurotrophic factor (GDNF) and GDNF mRNA in cerebral tissue after reperfusion of focal cerebral ischemia, and to elucidate picrorhizae in the protection of neuron. Methods Ischemic reperfusion models were established with intraluminal thread method in 36 adult healthy male Wist
4、ar rats. The rats in model group were given intragastric administration with picrorhizae, the expressions of GDNF and GDNF mRNA in cortex and striatum were determined respectively by immunohistochemical and in situ hybridization assay. Results In model group, the GDNF and GDNF mRNA positive neurons
5、increased from 6 h, peaked at 1 d in cortex and peaked at 3 d in striatum. Compared with operation group and shamoperation group, the expressions of GDNF and GDNF mRNA increased insignificantly in treatment group. Conclusion Picrorhizae could protect the neurons against cerebral hypoxiaischemic dama
6、ge by increasing the expressions of GDNF and GDNF mRNA. KEY WORDS Picrorhizae; Ischemic reperfusion; Glialderived neurotrophic factor; Rats, Wistar 神经营养因子及其受体可保护神经元，对抗低氧、兴奋性氨基酸、自由基、细胞内钙超载等病理改变。因此，提高内源性神经营养因子表达，促进半暗带神经元存活对脑卒中功能恢复有积极意义。最近研究表明，中药胡黄连甲醇提取物具有抗氧化和清除自由基的作用，在体外实验中可提高神经元存活率，增强神经生长因子诱导 PC12 神经
7、细胞轴突生长1。本研究建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，观察胡黄连甲醇提取物对脑缺血再灌后神经元损伤的作用。现报告如下。 1 材料和方法 1.1 动物和分组 健康雄性 Wistar大鼠 36只，清洁级，由山东大学动物实验中心提供，34 月龄，体质量为(24615)g。常规饲养，环境温度 22 。随机分为 3组，模型组 24只，治疗组 8只，假手术组 4只。应用改良线栓法2，经左侧颈外 颈内动脉插线建立大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注模型，模型成功的标志为动物苏醒后出现左侧 Horner征，提尾右前肢内收屈曲，爬行时右侧划圈。模型组又分为缺血 1.5 h再灌注 6 h、1 d、3 d、7 d、1
8、4 d、21 d组，每组 4只；治疗组又分为缺血 1.5 h再灌注14、21 d 组；假手术组仅插入尼龙线 10 mm，其余步骤同模型组。 1.2 实验方法 1.2.1 给药方法 模型组及假手术组大鼠每天给予生理盐水灌胃 1次，每次 3 mL；治疗组每天灌胃胡黄连甲醇提取物(1 g/L)1次，每次 3 mL。 1.2.2 脑组织取材 应用 10 g/L戊巴比妥钠麻醉大鼠，暴露心脏，先以生理盐水 200 mL经升主动脉冲洗，再以 40 g/L多聚甲醛 200300 mL灌注固定，持续 30 min 后取脑备用。取材范围为前囟后 2.0 mm至前囟前 3.0 mm。脑组织常规脱水、透明、浸蜡、石蜡
9、包埋，连续冠状切片（片厚 5 ） ，粘于用多聚赖氨酸处理的切片上，室温保存备用。 1.2.3 GDNF蛋白检测 采用免疫组化方法。兔抗鼠 GDNF一抗和SABC免疫组织化学试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。按说明书操作，一抗浓度为 1100，DAB 显色，细胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性着色，镜下根据细胞着色情况控制反应时间，室温下约 58 min，双蒸水冲洗终止反应；脱水、透明；中性树胶封片；免疫组化阳性细胞计数。以 0.1 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。 1.2.4 GDNF mRNA检测 采用原位杂交方法。GDNF mRNA原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。按
10、说明书操作，标本切片，脱蜡，梯度乙醇水化至水；依次滴加 H2O2、胃蛋白酶、预杂交液、杂交液、生物素化鼠抗地高辛、SABC 后，DAB 显色，镜下根据细胞着色情况控制反应时间，双蒸水冲洗终止反应；脱水，透明，封片。光镜下观察，细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞。取部分切片不加探针以 0.1 mol/L PBS代替作为阴性对照。 1.2.5 结果观察 参考 PAXINOS和 WATSON的大鼠脑图谱，光学显微镜下(400 倍)观察皮质、纹状体区 GDNF蛋白及 GDNF mRNA阳性细胞的数量，采用德国欧波同公司 VIDAS图像分析系统将每个标本的图像输入电脑，对阳性细胞作吸光度扫描,获得吸光度值。
11、 1.3 统计学处理 结果以s 表示，采用 SPSS 10.0统计软件进行数据处理，数据间比较采用方差分析。 2 结果 2.1 缺血侧皮质、纹状体区 GDNF蛋白的表达 与假手术组比较, 模型组缺血侧皮质区 GDNF蛋白表达阳性细胞于缺血再灌注 6 h后着色开始加深，1 d时达到高峰，与假手术组比较差异有显著性（F=14.168,q=12.565，P0.01） ，之后表达逐渐减弱，14 d降至基础水平；纹状体区 GDNF蛋白表达阳性细胞于缺血再灌注 1 d后着色开始加深，3 d达高峰，与假手术组相比较，差异均有显著意义（F=12.531,q=11.379，P0.01） ，之后表达逐渐减弱，14
12、 d 降至基础水平。治疗组缺血侧皮质区 GDNF蛋白表达阳性细胞含量于缺血再灌注14、21 d时明显高于假手术组和相应模型组, 差异有显著性（q=4.908、4.319，P0.05） ；治疗组缺血侧纹状体区 GDNF蛋白表达阳性细胞含量于缺血再灌注 14、21 d 时明显高于假手术组和相应模型组, 差异有显著性（q=5.172、4.345，P0.05 ） 。见表 1。 2.2 缺血侧皮质、纹状体区 GDNF mRNA的表达 假手术组大鼠脑皮质区和纹状体区 GDNF mRNA表达的时相变化规律与 GDNF蛋白表达基本相似，模型组缺血侧皮质区于缺血再灌注 6 h后阳性细胞着色开始加深，1 d时达到
13、高峰，其值与假手术组大鼠比较差异有显著意义（F=40.189，q=16.847，P0.01） ，之后表达逐渐减弱，14 d降至基础水平；纹状体区 GDNF mRNA表达阳性细胞于缺血再灌注 1 d后着色开始加深，3 d达高峰，与假手术组相比较，差异有显著意义（F=113.312，q=30.079，P0.01） ，之后表达逐渐减弱，14 d降至基础水平。治疗组大鼠缺血侧皮质区 GDNF mRNA反应阳性细胞含量于缺血再灌注 14、21 d均明显高于假手术组和模型组，差异有显著意义（q=0.003、0.031，P0.05、0.01） ；治疗组大鼠缺血侧纹状体区GDNF mRNA反应阳性细胞含量于缺
14、血再灌注 14、21 d时明显高于假手术组和相应模型组, 差异有显著性（q=5.013、3.731，P0.05、0.01） 。见表 2。 3 讨论 GDNF 是转化生长因子家族的新成员之一3，属半胱氨酸蛋白家族，是一糖基多肽。GDNF 是多巴胺能神经元存活和分化的高特异性营养因子，同时对海马锥体细胞、外周运动神经元亦有保护作用。在新生鼠的海马、纹状体、皮质、小脑区均有 GDNF mRNA的较高表达，提示在发育过程中GDNF对这些区域的神经元有支持作用；在成年鼠中，GDNF mRNA表达较低，但当脑内稳态环境改变，如缺血损伤时，可诱导 GDNF mRNA在一些脑区表达增加，特别是在对缺血损伤相对
15、耐受的脑区其表达明显高于易损脑区，提示 GDNF对缺血神经元的损伤有保护作用。研究发现，大鼠海马内注入 GDNF后，缺血诱发的酪氨酸羟化酶（TH）mRNA 水平降低，认为GDNF可通过调节 TH mRNA及其蛋白水平实现神经保护作用4。重组人类GDNF诱发促细胞分裂剂激活性蛋白激酶(MAPK)途径的活化,减少了 NMDA引发的钙内流,从而发挥神经保护作用。GDNF 可减小脑缺血后的梗死面积和脑水肿, 减轻 DNA断裂及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶免疫阳性反应5。MIYAZAKI 等6则观察到，GDNF 可减少短暂性前脑缺血模型中的迟发性神经元死亡。 表 1 缺血侧皮质、纹状体区 GDNF蛋白表
16、达（略） 与假手术组相比，F=14.168、12.531，*q=11.37912.565，P0.01；与模型组相比，q=4.3455.172，P0.05 表 2 缺血侧皮质、纹状体区 GDNF mRNA表达（略） 与假手术组相比，F=40.189、113.312，*q=16.84730.079，P0.01；与模型组相比，q=0.0035.013，P0.05 本实验利用大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型观察到，缺血再灌注 6 h后 GDNF蛋白表达阳性细胞着色开始加深，皮质区于 1 d时达高峰，纹状体区于 3 d达高峰；缺血再灌后皮质区和纹状体区 GDNF mRNA表达的时相变化规律与 GDNF蛋白表
17、达基本相似，支持 GDNF对缺血神经元的损伤有保护作用的观点。但是本文也同时观察到，脑缺血诱导的 GDNF表达增加时程短, 再灌注 14 d降至基础水平，难以对受损神经元起到全面而持久的保护作用。 胡黄连为我国传统中药，主要生物活性成分是环烯醚萜甙类。LI 等7报道，环烯醚萜甙类化合物具有增强神经生长因子诱导 PC12神经细胞轴突生长的作用。陶移文等1通过建立神经细胞自由基损伤模型观察到，胡黄连苷 可提高 PC12神经细胞的存活率，减少乳酸脱氢酶（LDH）的释放量,降低细胞内活性氧水平，对 PC12 神经细胞损伤具有明显的保护作用。张伟等8通过建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型观察到，胡黄连可下
18、调脑内 NMDA R1 mRNA表达，从而减轻兴奋性氨基酸的神经毒性，起到神经保护作用。本文观察了中药胡黄连甲醇提取物对缺血再灌大鼠脑 GDNF表达的影响，结果表明，治疗组缺血侧皮质区和纹状体区 GDNF蛋白表达阳性细胞含量于再灌注后 14、21 d均明显高于假手术组和模型组，差异有显著性；皮质区和纹状体区 GDNF mRNA表达阳性细胞含量于 14、21 d均明显高于假手术组和模型组，差异有显著性。提示胡黄连促进缺血再灌注后较长时程内 GDNF的合成是其神经保护作用的机制之一。 【参考文献】 1陶移文,刘建文,魏东芝,等. 胡黄连苷 在体外对 PC12 神经细胞损伤的保护作用J. Chin
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