1、胡黄连对大鼠缺血脑组织神经营养因子的影响作者：杨学伟 季旭明 郭云良 杜芳 【摘要】 目的 观察大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织神经生长因子（NGF）的变化，探讨胡黄连抗脑缺血再灌注损伤的机制。方法 参照线栓法制作脑缺血再灌注模型，免疫组织化学方法观察胡黄连对脑皮质、纹状体 NGF 表达的影响。结果 手术组缺血侧皮质区和纹状体区于缺血再灌注 1 d 时 NGF 表达至高峰，3 d 后逐渐下降，14 d 降至基础水平；胡黄连治疗组大鼠脑皮质与纹状体的 NGF 阳性细胞显著增加, 与假手术组及模型组相比差异有显著性（F=4.8、9.1，q=13.617.2；t=12.618.4,P0.05） 。结论
2、胡黄连可使脑缺血再灌注损伤后脑组织内 NGF 表达增加。 【关键词】 胡黄连；中草药；脑；再灌注损伤；神经生长因子 ABSTRACTObjectiveTo observe the changes of nerve growth factor (NGF) in rat brain following cerebral ischemial reperfusion and the mechanism of Picrorhizae on anticerebralischemia damage.MethodsA cerebral ischemic reperfusion model was establ
3、ished via intraluminal thread method and the effects of Picrorhizae on expression of NGF in pallium and striatum detected immunohistochemically.ResultsThe expression of NGF in cerebral cortex and striatum at ischemial side of operation group reached the peak at one day, declined gradually after thre
4、e days, returned to basal level on day 14; in Picrorhizaetreated group, the NGFpositive cells in the cortex and striatum increased dramatically, the differences were significant compared with the shamoperation and model groups (F=4.8,9.1;q=13.6-17.2;t=12.6-18.4,P0.05).ConclusionPicrorhizae can incre
5、ase the number of NGF in brain following cerebral ischemial reperfusion injury. KEY WORDSPicrorhizae; Medicine, Chinese herbal; Brain; Reperfusion injury; Nerve growth factor 神经营养因子(NGF)是一种多亚基蛋白组成的靶组织源性细胞因子，作为一种经典的神经营养因子，NGF 不仅在中枢神经系统发育过程中对神经元的生存、分化、生长起重要作用,而且在成熟的中枢和周围神经系统中具有维持神经元生存、终止特定神经元死亡及增加神经递质
6、合成等重要作用1。研究表明, NGF 在神经细胞培养模型中表现出良好的神经元保护作用，其能增加神经细胞在低氧复氧条件下的存活，并能促进神经元轴突生长。体内实验中，通过外源性补充及基因敲除等方法均证实了NGF 的神经保护作用2。本文观察了胡黄连对缺血不同时段脑组织皮质区和纹状体区 NGF 表达的影响,以探讨胡黄连抗脑缺血再灌注损伤的机制。1 材料和方法 1.1 实验动物和分组 健康雄性 Wistar 大鼠 36 只，34 月龄，体质量(24615)g，清洁级，由山东大学动物实验中心提供（合格证号：D20021236） ，常规饲养，环境温度 22 。随机分为模型组 24 只、治疗组 8 只和假手术
7、组 4 只。应用改良线栓法3，经左侧颈外 颈内动脉插线建立大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注模型，模型成功的标志为动物苏醒后出现左侧 Horner 征，提尾右前肢内收屈曲，爬行时右侧划圈。模型组又分为缺血 1.5 h 后再灌注 6 h、1 d、3 d、 7 d、14 d、21 d 组，治疗组分为缺血 1.5 h 后再灌注 14 d、21 d 组，每组各 4 只；假手术组仅插入尼龙线 10 mm，其余步骤同模型组。 1.2 治疗方法 模型组模型成功后即可灌胃，每天灌胃生理盐水 1 次，每次 3 mL。假手术组每天灌胃生理盐水 1 次，每次 3 mL。治疗组每天灌胃胡黄连甲醇提取物 1 次，每次 3
8、 mL。 1.3 脑组织取材 各组大鼠于术后不同时间点取材，10 g/L 戊巴比妥钠麻醉，暴露心脏，先以生理盐水 200 mL 经升主动脉冲洗，再以 40 g/L 多聚甲醛200300 mL 灌注固定，持续 30 min 后取脑备用。取材范围为前囟后2.0 mm 至前囟前 3.0 mm。脑组织常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，连续冠状切片（片厚 5 m） ，粘于用多聚赖氨酸处理的玻片上，室温保存备用。 1.4 免疫组化检测 NGF 免疫组织化学试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。按说明书操作，标本切片，脱蜡，梯度乙醇至双蒸水；依次滴加 H2O2、封闭血清、一抗（1100）及二抗后，DAB 显
9、色，镜下根据细胞着色情况控制反应时间，双蒸水冲洗终止反应，随后脱水、透明、封片，光镜下观察，细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞。取部分切片不加一抗，以 0.1 mol/L的 PBS 代替，用以观察一抗特异性。 1.5 数据与统计学处理 参考 PAXINOS 和 WATSON 的大鼠脑图谱，光学显微镜下(400 倍)观察皮质区、纹状体区 NGF 阳性细胞的数量，采用德国欧波同公司 VIDAS 图像分析系统将每个标本的图像输入电脑，对阳性细胞作吸光度扫描,获得吸光度值。应用 SPSS 10.0 统计软件包进行分析。 2 结 果 与假手术组相比较，模型组缺血侧皮质区、纹状体区于缺血再灌注后 NGF 阳性
10、细胞着色开始加深，于缺血再灌注 1 d 时 NGF 表达至高峰，3 d 后逐渐下降，14 d 降至基础水平。胡黄连灌胃后 14、21 d，治疗组大鼠缺血侧皮质区、纹状体区 NGF 表达明显高于假手术组和模型组(P0.01)。见表 1。表 1 缺血侧皮质、纹状体 NGF 的表达（略） 3 讨 论 NGF 免疫活性物质在脑内的含量高低依次为海马、大脑皮质、嗅球、基底前脑、小脑和纹状体。免疫组织化学、印迹杂交等技术证明 NGF 位于神经元胞体和突起内。在胚胎发育早期,NGF 能明显促进神经前体细胞的增殖并促进其分化1；神经损伤后, NGF 表达明显增强,NGF 对损伤神经元起保护作用。体内实验显示，
11、内源性的 NGF 缺乏能引起脑缺血损伤区的迟发性神经元死亡，侧脑室注入 NGF 可以延迟并预防胆碱能神经末梢损伤及预防迟发性神经元死亡46。体外实验也表明，NGF 能保护海马及皮质神经元免受低氧、低糖、谷氨酸毒性和氧化损害7,8，该作用可能与 NGF 抗自由基、抗兴奋性氨基酸的神经毒性、维持细胞内 Ca2+的稳态、抑制神经细胞凋亡等有关。由此推测，NGF 具有潜在的治疗脑缺血性神经损伤的作用。但实验表明，缺血性脑损伤引起的 NGF 表达增加时程很短,表达水平有限,难以对受损神经元起到全面而持久的保护作用。因此，如何增加脑内 NGF 以减轻脑损伤成为研究热点之一。胡黄连为我国传统中药，主要生物活
12、性成分是环烯醚萜甙类，具有抗炎、抗氧化等作用9。有关实验已观察到，胡黄连苷 有增强 NGF 诱导 PC12 神经细胞轴突生长作用，并可提高自由基损伤神经细胞的存活率1012。本研究观察到胡黄连可使大鼠缺血再灌注后 14、21 d 皮质区和纹状体区 NGF 反应阳性细胞明显增加，提示胡黄连使缺血再灌注后 NGF 表达增加可能是其神经保护作用的机制之一。 【参考文献】 1CATTANO E E, MCKAY R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cell regulated by nerve growth factorJ. Na
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