1、黄芪、党参提取物对小鼠 Matrigel 种植体血管生成的影响【摘要】 目的: 研究黄芪、 党参提取物对血管生成的影响, 为其抗肿瘤应用提供实验依据。方法: 采用 bFGF 诱导小鼠腹壁 Matrigel 种植体方法进行血管生成实验, Matrigel 与 bFGF 、 肝素混合后植入C57BL/6 小鼠腹壁正中区域皮下, 5 d 后取出, 分别测量 Matrigel 种植体中血红蛋白含量和微血管面积, 以此反应微血管的生成状况。在Matrigel 种植前 3 d, 给予不同剂量的实验药物, 连用 8 d 进行抑制实验。结果: 低剂量（50, V/V）黄芪、 党参提取物, 能促进Matrige
2、l 种植体内的血管生成, 而高剂量（60, V/V）则表现出抑制现象。这种促进和抑制作用具有一定的剂量 效应关系。结论: 不同剂量的黄芪、 党参提取物对微血管的生成具有不同的影响, 表现出中医药特有的双向调节作用。临床使用时应根据不同的目的, 选择不同的药物剂量。 【关键词】 黄芪 党参 血管生成扶正中药在肿瘤临床治疗中广为应用, 既往研究多以肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、 白介素(interleukin, IL)等细胞因子的变化, 解释其作用机制。本研究采用 Matrigel 种植体的方法, 观察传统扶正中药 黄芪、 党参提取物对碱性成纤维细胞生长因子
3、(basic fibroblast growth factor, bFGF) 诱导 Matrigel 种植体血管生成的影响, 从血管生成角度进一步探讨其抗肿瘤机制, 为临床应用提供实验依据。1 材料和方法1.1 材料 黄芪、 党参提取物 : 参芪注射液（SQ, 每 1 mL 含总皂甙3 mg , 总酚性物质 0.34 mg, 多糖类物质35 mg。广东丽珠集团利民制药厂馈赠）, 50 g/L 的葡萄糖稀释, 配制成 10%100%的实验浓度。1.2 方法1.2.1 Matrigel 的植入 以含 100 g/L 牛血清白蛋白的 PBS 液稀释 bFGF （BD Labware）至 2 g/L,
4、 稀释肝素至 1 U/L。取 bFGF 50 L（100 ng） 、 肝素50 L (50 U) 与冰浴中的 Matrigel （BD Labware）500 L 混匀, 皮下注射于 C57BL/6 小鼠（第四军医大学实验动物中心）腹部正中区域。5 d 后, 断颈处死小鼠, 手术切开腹部皮肤 , 取出 Matrigel 种植体, 生理盐水中清洗 23 次。1.2.2 血红蛋白含量测定 小鼠体内取出的 Matrigel 种植体置于干冰上干燥 12 h 称质量, 悬浮于 0.5 mL (1 g/L)TritonX100 中 12 h 并用吸管吹成悬液, 15 000 g 离心 15 min, 用分
5、光光度计测量上清中的血红蛋白 A405 值, 测定血红蛋白含量。1.2.3 微血管面积的测定 小鼠体内取出的 Matrigel 种植体福尔马林固定, 石蜡包埋, 制成 4 m 的切片, 常规脱蜡, 水化。先经 30 mL/L H2O2 阻断内源性过氧化物酶, 0.001 mol/L 枸橼酸缓冲液抗原修复, 再依次加入 30 mL/L 小牛血清、 兔抗 CD31 抗体、 生物素标记羊抗兔抗体、 SP 复合物。以上各步之间均经 37恒温孵育 30 min, PBS冲洗。最后 DAB 染色, 苏木素复染, 树脂封片。用 PBS 代替 CD31 作空白对照。盲法进行结果判断: 每只实验动物随机选出 5
6、 张切片, 先在低倍光镜（100）下检查整个切片, 找到并选取微血管面积最高的 3 个视野（热点）, 数码相机高倍镜下（200）摄片, 图象分析软件计算微血管面积。1.2.4 试验分组与处理 C57BL/6 只小鼠随机分为实验组和对照组, 实验组分为10%100（V/V）10 个剂量亚组, 每组 20 只, 10 只用于血红蛋白测定, 另外 10 只用于微血管面积观察。实验组小鼠于 Matrigel 种植前 3 d 开始, 分别以不同浓度的 SQ 3.0 mL 腹腔内注入, 1 次/d, 连续 8 d。对照小鼠（n=20）以等体积 50 g/L 的葡萄糖代替 SQ, 处理方法同实验组。1.2.
7、5 统计学处理 实验结果采用 xs 表示, 方差分析比较不同剂量组之间的血红蛋白含量和微血管面积, 血红蛋白含量和微血管面积与 SQ 剂量之间的相关性采用 spearman 等级相关分析。所有统计计算均在 SPSS12.0 软件上进行, 以 P0.05 为具有统计学意义。2 结果2.1 Matrige 种植体内血红蛋白含量 随着 SQ 浓度的增高, Matrigel 种植体内血红蛋白含量呈逐渐增高趋势, 相关性分析 r=0.417, P0.01, 40和 50剂量组血红蛋白含量较对照组明显增高。当 SQ浓度60, 则表现出抑制效应, 相关性分析 r=-0.510, P0.01, 80100剂量
8、组血红蛋白含量较对照组明显减少(表 1, 图 1)。表 1 Matrigel 种植体中血红蛋白含量的比较（略）2.2 Matrigel 种植体中微血管面积 对照组和 SQ 浓度50剂量组, 血管结构清晰、 内皮细胞着色较深（呈棕黄色）, SQ 浓度60后血管结构模糊、 内皮细胞着色变浅。与血红蛋白含量相同, SQ 浓度50时, Matrigel 种植体中微血管面积逐渐增多, 30以上浓度组与对照差异显著, 相关性分析r=0.449, P0.01。SQ 浓度60后表现为抑制效应, 随着剂量的增加, 最高可减少微血管面积的 19.8%, 相关性分析 r=-0.484, P0.01(表 2, 图 2
9、)。表 2 Matrigel 种植体内微血管面积的比较（略）3 讨论扶正中药是我国肿瘤临床治疗中应用最广泛的辅助药物。McCulloch 评价了 CBM、 MEDLINE、 TCMLARS、 EMBASE、 Cochrane 和 CCRCT 数据库中的 1 305 篇相关文献, 包括 34 个随机对照研究, 2 815 名患者后, 认为采用扶正中药组方（多数含有黄芪、 党参）联合含铂的化疗方案, 治疗进展期非小细胞癌, 患者的生存时间、 肿瘤反应、生活质量明显好于单纯化疗, 毒副反应也明显减轻, 此类药物在肿瘤综合治疗中的地位值得进一步评价1 。既往研究多从提高 TNF、 IL 等细胞因子表达
10、方面阐述扶正中药的抗瘤机制2 。但以上因子在肿瘤的发展中具有双向作用, 如 TNF 即可以抑制肿瘤生长, 又能促进血管生成、 参与肿瘤生长与转移。此外, 恶病质是导致患者虚弱的重要原因之一, 而 TNF、 IL6 等在恶病质的形成过程中也发挥了重要作用3 。因此, 仅以提高 TNF、 IL 表达解释扶正中药的抗癌机制不甚全面。董竞成等4采用 C57BL/6 小鼠 Lewis 肺癌模型, 观察黄芪注射液的直接抗瘤效果, 发现高剂量治疗组小鼠的肺重量和肺转移瘤数量明显减少, 存活时间明显延长, 同时 Th2 向 Thl 反应逆转。沈洪等5研究发现: 黄芪能抑制人胃癌细胞生长, 并能抑制人胃癌细胞C
11、OX2 、 VEGF 和 PGE2 的表达, 呈一定的量效特征。值得注意的是该研究发现黄芪在低浓度时促进胃癌细胞的生长, 只有达到一定的浓度后才能发挥抗肿瘤作用。高浓度的黄芪多糖在体外和荷瘤小鼠体内都表现出了直接的抗瘤效果, 具体机制与恢复或激活宿主的抗肿瘤免疫有关 , TNF、 淋巴因子激活的杀伤细胞在其中发挥了重要作用6 。在临床上, 不同的学科应用扶正中药的机制和剂量有所不同, TNF、 IL 等细胞因子的测量结果差异较大。如大剂量黄芪莪术合剂具有显著抑制博莱霉素致大鼠肺纤维化的作用, 抑制转化生长因子 1 及转化生长因子 1mRNA 的表达是其可能的机制之一7 。大剂量黄芪注射液配合糖
12、皮质激素治疗肾病综合征, 4 周后患者血清及尿液中 TNF 水平显著下降8 。高剂量的参麦能抑制牛内皮细胞迁移和鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成9 。我们采用血管生成实验的常用方法之一 Matrigel 种植体技术10, 观察不同剂量的黄芪、 党参提取物对血管生成的影响。结果表明: 低剂量使用时对血管生成具有促进作用 , 而高剂量则表现为抑制效应, 与董竞成、 沈洪、 Cho 等人的研究结果相似4-6 。这些发现提示: 扶正中药对血管生成具有“双向”影响, 临床上应根据不同的治疗目的选择不同的药物剂量, 在抗肿瘤治疗中选择何种剂量的扶正中药, 是一个值得探讨的问题。【参考文献】1McCulloch M
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