1、基因工程技术制备的人源性抗 Mr 48103 角蛋白抗体 Fab 片段的纯化与活性鉴定作者：李承新 刘玉峰 王刚 李春英 万业宏 【关键词】 角蛋白 关键词: 角蛋白;人源性抗体;Fab;制备;鉴定 摘 要:目的 用基因工程技术制备人源性抗角蛋白抗体 Fab片段，并对其纯度、抗原结合活性及特异性等进行鉴定. 方法 将从半合成噬菌体抗体库中成功地筛选到的特异表达抗角蛋白 Fab片段的阳性克隆转化大肠杆菌，IPTG 诱导表达，产物经金属鏊合层析纯化，并用 ELISA鉴定抗原结合活性和特异性、SDS-PAGE 鉴定纯度和蛋白印迹检测抗角蛋白抗体 Fab片段识别的抗原组分. 结果 可溶性表达的抗角蛋白
2、抗体 Fab片段经金属鏊合层析可有效地纯化，蛋白印迹明确纯化产物为人 Fab片段.所纯化的 Fab片段在非还原 SDS-PAGE中形成 Mr 50103 单一条带，在还原 SDS-PAGE中可见 Mr 23103 ，Mr 25103 两条带.ELISA 和Western blot证实该片段具备良好的抗原结合活性和抗原特异性. 结论 成功表达并鉴定了人源性抗 Mr 48103 角蛋白的 Fab可溶性片段，为人源性抗角蛋白抗体工程化、进一步研究该抗体的生物活性并提高其临床应用价值奠定了良好的基础. Keywords:keratin;human antibody;Fab;preparation;i-
3、dentification Abstract:AIM To express human Fab fragment against Mr 48103 keratin in E.coli，and identify its purity，combining activities with antigens and antigenic specificity.METHODS The specific anti-48kd keratin clone was selected from the established semisynthetic phage antibody library and tra
4、ns-formed into E.coli xL1-blue.The specific Fab fragments were expressed by using IPTG as inducing agent.After being purified by immobilized metal ion affinity chromatography（IMAC） ，the expressed products were verified by ELISA，SDS-PAGE and Western blot.RESULTS Soluble anti-ker-atin-Fab fragment cou
5、ld be efficiently purified by IMAC，and the purified products were identified to be human Fab frag-ment by Western blot.The purified Fab fragment formed a single band under non-reducing conditions and two bands un-der reducing conditions in SDS-PAGE.The purified Fab fragment possessed good antigenic
6、specificity as well as the excellent combining activities with antigens as verified by ELISA and Western blot.CONCLUSION The high level expression and identification of soluble human anti-keratin-Fab fragment may lay a potentially good foundation of engi-neering human anti-keratin Fab，of further res
7、earching its bi-ological activities and of facilitating its potential clinical appli-cation. 0 引言 1989 年以来，直接利用噬菌体显示技术（phage display technology）筛选和制备目标抗体获得成功.该技术不经杂交瘤途径，就可以制备和生产单克隆抗体.因此，被誉为单克隆抗体制备技术上的革命性进展1 .我们曾利用该技术自半合成噬菌体抗体库中成功地筛选到人源性抗角蛋白抗体2 ，为准确、深入地了解 AK auto Ab的功能和阐明抗角蛋白抗体临床应用的前景，我们将筛选到的特异表达抗角蛋白
8、Fab片段的阳性克隆，在大肠杆菌 XL1-blue中成功表达，并用金属螯合层析法进行了纯化.产物经鉴定具备良好抗原特异性和抗原结合活性. 1 材料和方法 1.1 材料 从噬菌体抗体库中筛选出的人源性抗 Mr 48103 角蛋白的 Fab阳性克隆 RRKZ由海军总医院中心实验科王刚提供.该抗 Mr 48103 角蛋白的 Fab阳性质粒含有抗角蛋白抗体的全部轻链基因（CL+JL+VL）及木瓜酶酶切位点以上部分的重链基因（CH1+JHD+VH） ，两部分基因克隆于可溶性 Fab表达载体 p3MH.该载体系在 pCOMB3H的基础上于基因3端加了 6个组氨酸编码序列，以利于表达产物的纯化.表达产物为人
9、源性抗角蛋白的 Fab片段.诱导剂:异丙基-D 半乳糖苷（IPTG） （Promega）.人表皮角蛋白抗原和 IgG型 AK auto Ab由本室制备.HRP-羊抗人 IgG Fab抗体及镍离子螯合层析柱分别为 Sigma公司和Pierce公司产品. 1.2 方法 1.2.1 人源性抗角蛋白 Fab片段的原核表达 将阳性克隆 RRKZ的质粒转化大肠杆菌 XL1-blue，挑取单集落在 1.5mL2YT培养液中振荡培养至A600nm 0.6，然后按 1100 扩大培养，3h 后加 IPTG至终浓度为1mmolL-1 ，37诱导过夜.次日收集菌液离心，上清中即含有可溶性 Fab抗体. 1.2.2
10、人源性抗角蛋白 Fab片段的纯化 人源性抗角蛋白 Fab片段的纯化步骤基本按试剂盒说明进行.方法是:人源性抗角蛋白 Fab片段原核表达上清先用 50%饱和度硫酸铵盐析沉淀，pH6.8 平衡缓冲液透析后上柱，分别用洗涤缓冲液 1和洗涤缓冲液 2洗脱非特异结合的蛋白，再用洗脱缓冲液解离特异的 Fab片段，收集解离液，透析后经 BCA蛋白检测试剂盒定量备用. 1.2.3 人源性抗角蛋白 Fab片段的纯度与结合活性 纯化产物经100gL-1 SDS-PAGE鉴定纯度，并用纯化抗体与角蛋白以及无关抗原 HBsAg、结蛋白、铁蛋白、胃蛋白酶等的 ELISA反应判断其结合活性和特异性.各种抗原均以碳酸盐缓冲
11、液（pH9.6）稀释至1.25mgL-1 包被酶联板 4过夜，经 10gL-1 BSA封闭后滴加 110 和 1100 稀释的纯化抗体洗脱液 37孵育1h，PBS（Tween-20）洗涤，加 12000HRP-羊抗人 IgG Fab37孵育1h，再次洗涤后 OPD显色测定 A490nm 值. 1.2.4 蛋白印迹检测 用于检测 Fab的表达情况以及鉴定人源性抗角蛋白 Fab结合角蛋白的组分.将纯化样品在 100gL-1 胶浓度下进行 SDS-PAGE电泳，并电转移至硝酸纤维素膜上，以 50gL-1 脱脂奶粉-PBS4封闭过夜，用辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG Fab抗体结合，孵育、洗涤，DA
12、B 显 色;将角蛋白抗原在 100gL-1 胶浓度下进行 SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，转移至硝酸纤维素膜，以 50gL-1 脱脂奶粉-PBS4封闭过夜，滴加纯化的人源性抗角蛋白 Fab，室温摇床孵育 2h，洗涤，加用辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG Fab抗体再次孵育，洗涤，DAB 显色. 2 结果 2.1 人源性抗角蛋白 Fab表达与纯化 用 BCA蛋白定量检测试剂盒及 ELISA定量估算，培养上清中可溶性 Fab段表达的含量为120gL-1 .表达上清经 50%饱和硫酸铵沉淀后，溶于 PBS对平衡液充分透析后上柱，用 50倍柱床体积的洗涤缓冲液充分洗涤后，用洗脱缓冲液解离，解
13、离体积与蛋白浓度的相关曲线形成一锐利的单峰.收集解离液，经 BCA蛋白检测试剂盒定量，计算回收率为 47.2%. 2.2 可溶性抗角蛋白 Fab纯度鉴定 为鉴定经金属螯合层析所纯化的 Fab段的纯度，将样品浓缩后进行 SDS-PAGE（Fig1）.可以看出，在还原条件下，可以看到 Mr 25103 的 Fd段和 Mr 23103 的 链.在非还原条件下进行 SDS-PAGE，可见到 Mr 50103 的 Fd与 链的双聚体.进一步证实纯化组分中 95.0%以上为 Fab段蛋白. 图 1 略 2.3 可溶性抗角蛋白 Fab片段的抗原结合活性 从用 1100 稀释的抗角蛋白 Fab与各种抗原反应的
14、测定结果（Fig2）中可以看出，抗角蛋白 Fab片段与角蛋白具有良好的结合活性，而与 HBsAg、结蛋白、胃蛋白酶和铁蛋白等无关抗原不结合，说明抗角蛋白 Fab片段的特异性良好. 图 2 抗角蛋白 Fab与各种抗原的结合活性 略 2.4 蛋白印迹检测结果 Fig3为蛋白印迹检测结果.将 Fab片段先进行 SDS-PAGE后转膜，再用辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG Fab抗体进一步显色，表明表达、纯化的产物为人源性 IgG抗体的 Fab片段（F）.标准角蛋白抗原经电泳并转印到硝酸纤维素膜以后，用我们制备的抗角蛋白 Fab片段进行染色，约在 Mr 48103 处出现着色条带，其他部位和阴性对照无
15、着色（K） ，说明该抗体特异性地识别 Mr 48103 的角蛋白，与其他分子质量的角蛋白无交叉反应. 图 3 Western blot分析人源性抗角蛋白抗体可溶性表达产物 略 3 讨论 人体内广泛存在的天然自身抗体对维持机体内环境的自身稳定起着重要的作用3，4 .天然抗角蛋白自身抗体不仅是机体免疫调节网络的重要组成部分，而且，在一些病理情况下有可能影响疾病的发展过程，有潜在的临床应用价值5，6 .因此，积极探讨和研究抗角蛋白自身抗体临床应用的可能及其作用机制具有重要意义.我们曾经尝试用不同滴度 AK au-toAb的动物模型7 或应用免疫球蛋白来研究天然抗角蛋白自身抗体对皮肤疾病8-10 的影
16、响，但影响因素非常多.通过角蛋白亲和层析柱11 自正常人血清中纯化 AK autoAb 12 ，并用其来观察该抗体对培养角质形成细胞13 或某些皮肤病的影响14 ，虽然在一定程度上阐明了 AK autoAb的作用及机制，但是，由于提取的抗角蛋白抗体是针对多种表皮角蛋白的多克隆抗体，使用自正常人血清中纯化的 AK autoAb作为研究手段尚无法明确针对某一特定分子质量角蛋白的作用，而且，血液制品临床应用的安全性问题愈发引人关注.因此，要想准确、深入地了解 AK au-toAb的产生机制及功能，加快 AK autoAb临床应用的进程，设法制备人源性单克隆抗角蛋白抗体是十分必要的. 噬菌体抗体库技术
17、为人源性单抗的制备提供了简便、有效的途径.我们利用该技术从半合成噬菌体抗体库中克隆了人源性抗角蛋白抗体2 ，并成功地得到了可溶性表达的 Fab段.有效纯化所表达的抗体分子片段才能得到有实用价值的抗体制品，故纯化方法十分重要.从表达上清中纯化抗体分子片段通常采用亲和层析或离子交换层析的方法，但后者选择性差.由于我们在构建克隆表达载体时插入了聚组氨酸尾巴15 ，因此，可以利用聚组氨酸与金属镍离子发生螯合并通过改变 pH值而解离的特点将抗体蛋白从大肠杆菌表达上清中纯化出来.一般用的层析洗脱条件是强酸或高盐，容易损伤抗体的空间结构，损害抗原结合能力.我们使用商品化的中性洗脱溶液能有效保护抗体的活性.纯
18、化的样品经 ELISA检测表明具有与角蛋白结合的能力. 通过 SDS-PAGE电泳和免疫印迹证明了纯化产物为人源性 Fab片段，但是，Fab 片段的抗原结合活性和特异性是反映所获抗体生物学活性的最主要指标.纯化的样品经 ELISA和 Western blot检测证明不仅具有良好的抗原结合活性，而且，具有相当高的特异性，仅识别 Mr 48103 的角蛋白，与其他抗原或其他分子质量的角蛋白无交叉反应.Mr 48103 的角蛋白相当于 K16，是银屑病等表皮过度增殖性疾病的标记蛋白，并不存在于正常表皮角质形成细胞内16，17 .我们发现，针对 Mr 48103 角蛋白的鼠源性单抗 5G5能够抑制表皮
19、角质形成细胞的增殖，提示本实验所获得的具有良好结合活性和特异性的 Fab基因工程抗体有可能通过识别 Mr 48103 角蛋白分子而发挥类似鼠源性单抗的抑制效应.我们的工作使最终生产有活性的工程化人源性抗角蛋白基因工程产品成为可能，为研究该抗体的生物学活性奠定了基础，同时也为在此基础上进一步改建该抗体、提高其临床应用价值提供了前提. 参考文献: 1Huse WD，Sastry L，Iverson SA.Generation of large combina-torial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda J.Scie
20、nce，1989;246:1275. 2Wang G，Hua B，Wang Y，Liu YF.Cloning of human anti-ker-atin antibodies from semisynthetic phage antibody library J.Zhongguo Mianyixue Zazhi（Chin J Immunol） ，2000;16（1）:5-7. 3Coutinho A，Kazatchkine MD，Avrameas S.Natural autoanti-bodies J.Curr Opin Immunol，1995;7:812-818. 4Lacroix-De
21、smazes S，Kaveri SV，Mouthon L，Ayouba A，Malanchere E，Coutinho A，Kazatchkine MD.Self-reactive an-tibodies（natural autoantibodies）in healthy individuals J.J Immunol Methods，1998;216:117-137. 5Iwatsuki K，Imaizumi S，Hashizume，H，Sugaya K，Takigawa M，Yamada M.Production of antikeratin autoantibodies by hy-br
22、id cells of naive mice J.Br J Dermatol，1990;123:735-744. 6Serre G，Vincent C，Viraben R，Soleibavoup JP.Natural IgG and IgM autoantibodies to epidermal keratins in normal human sera.I ELISA-titration，immunofluorescence study J.J In-vest Dermatol，1987;88:21-27. 7Liu YF，Liu YF，Ding HY，Zhang TS，Che NZ.Dya
23、nemic ob-servation of the effect of AK autoAb on the epidermis autograft J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1990;11（5）:468-469. 8Liu YF，Liu YF，Zhang TS，Che NZ，Wang HY.Influence of variation of AK auto Ab titer on the skin burn J.Zhonghua Pifuke Zazhi（Chin J Dermatol） ，1992;6（2）:67-68
24、. 9Liu YF，Liu YF，Ding HY，Che NZ，Zhang TS.Influence of AK auto Ab on the allergic contact dermatitis J.Zhonghua Pifuke Zazhi（Chin J Dermatol） ，1992;6（1）:8-9. 10Li CX，Liu YF.Preliminary studies on the psoriasis with gamma human globulin and its mechanism J.Di-si Junyi Daxue Xue-bao（J Fourth Mil Med Un
25、iv） ，1996;17（5）:395-396. 11Li CX，Liu YF，Liu YF.Preparation of keratin affinity column J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1994;15（3）:231-232. 12Li CX，Liu YF，Liu YF，Zhang TS.Extraction and identifica-tion of antikeratin autoantibodies rom normal human serum J.Zhonghua Pifuke Zazhi（Chin J Dermatol） ，1995;28（4）:248-249. 13Li CX，Liu YF，Liu YF，Zhang YG.Effects of purified
