1、激光扫描共聚焦显微镜观察贲门肿瘤细胞药物诱导后 Ca2+浓度变化的意义作者：张向阳 门金娥 郑海萍 田珂 刘建霞 【关键词】 激光扫描共聚焦;显微镜；肿瘤；消化道 【关键词】 激光扫描共聚焦;显微镜；肿瘤；消化道 0 引言 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）是当今世界上最先进的分子细胞生物学分析仪器1. 使用钙高度特异性荧光指示剂 Flou3/Am 能观察到细胞内 Ca2+浓度变化. 大量实验证明,在多种刺激因子作用不同细胞诱导凋亡或病理条件下细胞自发凋亡的过程中，都普遍存在胞质钙的持续升高2. 我们通过 LSCM 检测化疗药物引起贲门肿瘤细胞 Ca2+浓度的变化，并同用 MTT 法测得的药敏结
2、果比较，以探讨 Ca2+浓度变化与药敏的关系. 1 材料和方法 1.1 材料标本均来源于河北工程学院附属医院手术切除的贲门肿瘤组织；MTT(Sigma 公司)；RPMI1640(Gibco 公司)；Flou3/Am(Biotium 公司)；顺铂(山东省德州制药厂)；甲氨蝶呤(北京医科大学实验药厂)；阿霉素(明治医药有限公司)；丝裂霉素(上海新亚药业有限公司)；5 氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司)；LSCM MRC1024(BioRad)；二氧化碳培养箱（Sanyo 公司）. 1.2 方法将肿瘤组织置入含 RPMI1640 培养液的无菌器皿中，机械方法制成细胞悬液，调整细胞密度为（13）10
3、8/L. 将细胞悬液接种于96 孔培养板（90 L/L） ，置 50 mL/L CO2, 37二氧化碳孵箱内培养 4 h，分 2 组分别加入顺铂、甲氨蝶呤、阿霉素、丝裂霉素和 5 氟尿嘧啶 5种化疗药物（10 L/孔） ，并设空白孔和对照孔 . 继续培养 12 h 后取一组 96 孔板，收集细胞液，加入 50 L Fluo3/AM (10 mol/L), 继续孵育 1 h，洗去多余的 Fluo3/AM，用 LSCM 检测细胞内 Ca2+浓度变化. 细胞培养 72 h 后，取一组 96 孔板，弃去上清，每孔加入 2 g/L MTT 20 L,继续培养 4 h，每孔加入二甲基亚砜 150 L，室温
4、振荡 10 min，用酶标仪（=550 nm）测定每孔吸光度（A）值. 相对抑制率（%）=（对照组A-加药组 A）/对照组 A100%，相对抑制率30%为敏感，相对抑制率30%为不敏感. 数据采用 PEMS3.1 软件进行 Wilcoxon 秩和检验. 2 结果 化疗药物引起的贲门肿瘤细胞内 Ca2+浓度变化与药敏关系见表 1. 敏感药物与不敏感药物引起的贲门肿瘤细胞 Ca2+浓度变化之间具有显著差别（P0.05）,敏感药物引起的贲门肿瘤细胞内 Ca2+的浓度变化明显大于不敏感药物. 表 1 贲门肿瘤细胞内 Ca2+浓度的变化与 MTT 药敏结果比较（略） 3 讨论 研究证明，目前使用的许多抗
5、癌药均可在不同类型的敏感肿瘤细胞中诱导凋亡. 药物的抗肿瘤效果不仅取决于药物对靶细胞的直接作用，更在于其诱导敏感肿瘤细胞凋亡的能力. 化疗诱导细胞凋亡的机制分三个阶段, 在最后一个阶段，化疗药物仅能使对其敏感的细胞而非耐受细胞产生凋亡的 bax 基因表达,最后导致凋亡发生,选择敏感药物诱导细胞凋亡成为化疗的目的. Ca2+作为参与许多生命活动的关键第二信使，在细胞凋亡中的作用受到普遍关注3. Ca2+本身就是一种诱导细胞凋亡的信号，已得到多方面的证实. 临床抗癌药物筛选常用 MTT 比色法，但 MTT 比色法需 3 d 时间，在药敏结果出来之前，患者的用药在很大程度上尚靠经验去选定化疗药物.
6、发生凋亡的细胞最早可以测及的生物变化是细胞内快速持续的 Ca2+浓度的升高，我们使用化疗药物作用贲门肿瘤细胞后，将 LSCM 检测的 Ca2+浓度变化与 MTT 法测得的药敏结果相比较，结果显示与不敏感药物相比，敏感药物能引起贲门肿瘤细胞 Ca2+浓度的更大变化，通过 LSCM 检测化疗药物诱导后贲门肿瘤细胞 Ca2+浓度变化，可以在 MTT 药敏结果出来之前为临床用药提供参考. 【参考文献】 1 王春梅，黄晓峰，李玉松,等. 激光共聚焦显微镜与荧光显微镜在医学研究中的比较J. 第四军医大学学报, 1997, 12: 62-63. 2 Nicotera P,Orrenius S. The role of calcium in apoptosisJ. Cell Calcium, 1998,23(23):173-180. 3 Rizzuto R, Pinton P, Ferrari D, et al. Calcium and apoptosis:facts and hypothesesJ. Oncogene, 2003,22(53):8619-8627.
