1、季节性联合呼吸道过敏患者血清特异性 IgE和粘附分子分析作者：张利萍， 王莲芸，王怀云【摘要】 目的 探讨季节性联合呼吸道过敏性患者的发病原因。方法 对 52 例既患过敏性鼻炎，又患支气管哮喘患者采用荧光酶联免疫法(FEIA)定量检测血清总 IgE 和特异性 IgE；用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量分析血清可溶性细胞间粘附分子-1（sICAM-1）和 E-选择素（sE-Selectin） 。结果 患者组的血清总 IgE 显著高于正常对照组；在 52 例季节性联合呼吸道过敏患者中可检测到过敏原的特异性 IgE 的为蒿花粉 43 例（82.7%） 、屋尘螨 26 例（50%） 、屋尘 15 例
2、（28.8%） 、草花粉 12 例（23%） 、粉尘螨 3 例（5.8%） ；试验组的 sICAM-1 算术均数（378.61 ng/ml）较对照组（213.42 ng/ml）明显增高（P0.0001） ；试验组的 sE-Selectin（62.61 ng/ml）高于对照组（35.72 ng/ml） ，P0.0001。结论 引起这 52 例季节性呼吸道过敏性炎症的主要因素为蒿花粉，其次是屋尘螨，季节性联合呼吸道过敏性患者高表达的细胞间粘附分子-1 和 E-选择素。【关键词】 联合呼吸道过敏； 过敏性鼻炎； 支气管哮喘； 血清特异性 IgE； 粘附分子【Abstract】 Objective T
3、o study pathogenesis of united seasonal airways hyperreactivity.Methods We investigated the relationship between specific IgE and soluble cellular adhesion molecular in 52 patients and 20 health persons. The sera total IgE(tIgE) and specific IgE (sIgE) were measured by a fluoroenzymeimmunoassay (Uni
4、-CAP Pharmacia， Uppsala， Sweden). The sera soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) and E-selectin were performed with ELISA.Results There were 43 patients (82.7%) suffered from artemisia pollen， 26 (50%) from house dust mite， 15(28.8%) from house dust， 12(23%) from humulus pollen and 3(5
5、.8%) from dermatophagoides farinae in 52 patients. The values of sICAM-1，sE-selectin and tIgE in combined allergic rhinitis and asthma patients were significantly higher than those of control（P0.0001）.Conclusion The results demonstrate that the expression of sera sICAM-1 and sE-selectin in united ai
6、rways hyperreactivity are higher than that of health persons. The allergens of induced united seasonal inflammation mainly are artemisia pollen， secondly house dust mite.【Key words】 united airway hyperreactivity；allergic rhinitis；bronchial asthma； IgE；adhesion molecular季节性呼吸系统的过敏性疾病包括上呼吸道的季节性变应性鼻炎和下
7、呼吸道的支气管哮喘。通常情况下对变应性鼻炎和支气管哮喘分别进行研究，但是，在临床上经常会遇到同一个病人既有发作性打喷嚏、流大量的清水样鼻涕，又有支气管哮喘发作（联合呼吸道过敏症） 。那么，这类患者的主要发病原因是什么？其血清中的总 IgE、特异性 IgE、血清可溶性细胞间粘附分子-1（sICAM-1）和 E-选择素（sE-Selectin）有何变化？对此本文进行了探讨。 1 资料与方法52 例联合呼吸道变态反应患者（男 25 例、女 27 例） ，在每年7、8、9 月主要表现为连续打 5 个喷嚏、流清水样鼻涕，鼻塞、咽喉痒、阵发性咳嗽和呼吸困难、咯大量白色泡沫状痰，夜间不能平卧，在发作期体格检
8、查可见下鼻甲黏膜呈苍白色或淡粉白色水肿状，咽部充血，两肺可闻及哮鸣音，病程最短的 2 年，最长的 20 年。另设正常对照组 20例（男 10 例，女 10 例） ，既往无特殊病情记载，体检未发现心肺、肝、脾、泌尿和血液等疾病。患者组（试验组）和对照组的年龄均在 1548岁之间。对试验组和对照组均空腹采血 2ml，常温下静置 2h，取血清分装在3 支 ependorf 管中，-70存放，备用。1.1 血清总 IgE（tIgE）和特异性 IgE（sIgE）定量测定（荧光酶联免疫法） 取患者血清 50l，加入到被特异性抗原包被过的经预洗的CAP 中，37孵育后，洗去未结合的血清，加入 -半乳糖苷酶标
9、记的抗IgE 抗体，继续孵育后再冲洗，再加入底物 4-甲基伞桂 -半乳糖苷，以终止液终止反应，并测定其吸光值。从标准曲线上读出相应的特异性 IgE的含量（WHO 75/502 标准：0.35100 ku/L） 。上述过程均在 Uni CAP 系统-100 型(Pharmacia)自动完成，所有试剂均由 Pharmacia 公司提供。试验组检测血清屋尘螨（d1） 、粉尘螨（d2） 、屋尘（h1） 、蒿花粉（w6） 、草花粉（w22）的特异性 IgE。试验组和对照组均测血清总 IgE。1.2 血清可溶性粘附分子分析 sICAM-1 和 E-选择素采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。1.2.1 实验
10、原理 首先将抗 sICAM-1 和抗 sE-Selectin 的抗体分别包被在不同的免疫板微孔的壁上，再将稀释 20 倍的血清分别加入不同的已包被的免疫板的微孔内，形成 sICAM-1 与抗 ICAM-1 的结合物、sE-Selectin 与抗 E-Selectin 的结合物；然后，这两种结合物分别与辣根过氧化酶标记的抗抗体（anti-ICAM-1-HRP、anti-E-Selectin-HRP 酶标二抗）结合，形成 sICAM-1anti-sICAM-1anti-ICAM-1-HRP、sE-Selectinanti-E-Selectinanti-E-Selectin-HRP 复合物。最后加入
11、底物（四甲基联苯胺） ，与辣根过氧化酶发生反应，产生有色物质，在波长 450620nm 读光密度值（OD 值） 。根据标准品描记出标准曲线，计算其每一样品的 sICAM-1、sE-Selectin 的含量。1.2.2 实验步骤 (1)按 1：20 浓度稀释待测血清；(2)在免疫板的微孔中分别加入 100lanti-ICAM-1-HRP、anti-E-Selectin-HRP；(3)再分别加入 100l 标准品、样品稀释液、质控参数液；(4)盖板后室温下孵育 1.5h；(5)用缓冲液洗板 6 遍；(6)分别加底物 100l 盖板后，室温下再孵化 30min；(7)加 100l 终止液；(8)在酶
12、标仪上选定波长为450nm 测吸光值，620nm 作为校正值；(9)制作标准曲线；(10)根据标准曲线将每一测试样品的 OD 值换算出 sICAM-1 和 sE-Selectin 的含量（ng/ml） 。其试剂从英国 RD Systems 购买，酶标仪为 Bio-Rad（美国）产品。1.3 统计学处理 采用 SPSS12.0 软件对两组资料进行正态性检验、方差齐性检验和 t 检验。2 结果2.1 特异性 IgE（sIgE）定量测定结果 在 52 例季节性联合呼吸道过敏患者中可检测到过敏原的特异性 IgE 的为蒿花粉 43 例（82.7%） 、屋尘螨 26 例（50%） 、屋尘 15 例（28.
13、8%） 、草花粉 12 例（23%） 、粉尘螨 3例（5.8%） ，见表 1。表 1 52 例联合呼吸道过敏患者血清特异性 IgE 定量（ku/L）分析结果2.2 血清总 IgE 测定结果 试验组与对照组的血清 tIgE（ku/L）的含量呈正偏态分布。试验组的血清 tIgE 几何均数（2.61）显著高于对照组（1.39） ，P0.0001。2.3 血清可溶性粘附分子定量分析结果 试验组的血清可溶性细胞间粘附分子-1（sICAM-1）和 E-选择素（sE-Selectin）的含量均呈正态分布，方差齐性检验示方差齐；双侧 t 检验提示两组间差异有非常显著性。试验组的 sICAM-1 算术均数（37
14、8.61 ng/ml）较对照组（213.42 ng/ml）明显增高（P0.0001） ；试验组的 sE-Selectin（62.61 ng/ml）高于对照组（35.72 ng/ml） ，P0.0001，见表 2。表 2 血清可溶性粘附分子（ng/ml）比较注：*P0.00013 讨论变应性鼻炎和支气管哮喘均是由 IgE 介导型变态反应，本研究采用荧光酶联免疫法对 52 例既有季节性过敏性鼻炎，又有季节性哮喘发作的患者进行血清总 IgE 定量分析发现，患者组高于对照组（P0.0001） 。进一步对这 52 例夏秋季联合呼吸道过敏患者进行了 5种吸入性变应原的血清特异性 IgE 定量分析发现，阳性
15、例数依次为蒿花粉 43 例（82.7%） 、屋尘螨 26 例（50%） 、屋尘 15 例（28.8%） 、草花粉 12例（23%） 、粉尘螨 3 例（5.8%） 。由此可见，引起这 52 例季节性呼吸道过敏性炎症的主要因素为蒿花粉，其次是屋尘螨。在我国北方地区夏秋季节的主要致敏花粉是蒿花粉，这与笔者过去的研究结果相一致的1 。虽然在不同的国家和地区花粉过敏的种类不一样，但是，花粉既可以引起过敏性鼻炎、结膜炎、咽炎、皮肤风团，也可引起下呼吸道过敏性炎症2 。对花粉过敏者建议：在花粉漂散的高峰期应关闭窗户（例如在傍晚，气传花粉从高空沉降到地面附近） ，外出时可以考虑用口罩，防止吸入花粉，不要亲自去
16、剪草。在剪草时要关闭窗户，也可使用空调或花粉过滤器。屋尘螨既是引起常年过敏的主要因素，也是夏秋加重或直接导致过敏的重要因素，甚至会促进患者对卵清蛋白的过敏，加重呼吸道的过敏性炎症3 。在显微镜下的尘螨约 0.33mm，无视力，有八只腿。它靠吃人体每天脱落下来的皮肤鳞屑生长繁殖，尘螨最具变应原的部分是躯干和粪小球。屋尘螨是世界上引起哮喘的最主要的变应原4 ，且发病率也高。研究发现：螨引起过敏的主要成分有两种蛋白，一种是 MW 25 kDa，另一种是MW15kDa。Marjiorie 等发现屋尘螨的同源变应原具有多样性。他们从屋尘螨中分离出 47 种同源变应原蛋白，其中 22 种变应原蛋白与 16
17、 例哮喘患者的血清 IgE 结合率在 50%以上。并发现这些蛋白具有交叉反应。屋尘螨以人体脱落的皮屑为食物，床上螨及螨的解体物质含量极高，人从一出生就躺在床上，对螨的接触最早，对其过敏的人也最多。因此，对屋尘螨过敏者通过经常用 5560的热水清洗床上用品（每 12 周 1 次） ，来达到减少室内尘螨过敏原数量的目的。炎症的本质就是有白细胞从血管腔出去浸润到血管外的组织中，对于变态反应性炎症而言也不例外。与过敏反应有关的白细胞主要是嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞。已有研究证实白细胞从血管的轴流进入边流，在沿血管内皮“滚动” （rolling） ，最后穿过内皮细胞间隙移行到组织中的每一步都需要细胞粘附分子
18、和相应配体（ligand）的共同作用5 。ICAM-1 属于粘附分子免疫球蛋白超家族中的成员，是膜糖蛋白，具有 90100 个氨基酸的环状类似物，并有免疫球蛋白样的轻链和重链区的特征，在分子结构上与免疫球蛋白具有很大的同源性。ICAM-1 由76114kD 氨基酸组成，核心部分的多肽约重 55kDa。它由一短的细胞膜区（巯水跨膜结构）和 5 个细胞外的免疫球蛋白样的区域组成。ICAM-1的基因位于第 19 号染色体上。ICAM-1 的配基是淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1） 。在正常情况下，ICAM-1 在不同的组织中都有表达，但在炎症组织中 ICAM-1 的表达更为广泛。有人给患呼吸道变
19、态反应性疾病的猴子吸入或静滴抗 ICAM-1 的单克隆抗体后，发现其气管上皮和黏膜下的嗜酸粒细胞减少，受试猴子的气道高反应亦被阻断，从而揭示 ICAM-1 在嗜酸粒细胞-内皮细胞的相互作用中起着重要作用，在哮喘的发病中发挥着至关重要的作用6 。另外，在变态反应炎症中，ICAM-1 可能在呼吸道病毒性疾病恶化过程中是一个关键性的因子，因为 ICAM-1 也是鼻病毒的表面受体。E-选择素亦称内皮性白细胞粘附分子-1(ELAM-1)，主要在内皮细胞受刺激 2h 之内表达，它与白细胞表面的 Sialyl-Lewis X 糖蛋白粘附。在选择素间的相互作用后，促进了内皮细胞上的 ICAM-1 和白细胞表面
20、的2 整合素的粘附。2 整合素与 ICAM-1 的粘附是白细胞移行的关键，即白细胞经过内皮细胞，最后出了血管腔外。ICAM-1 和 E-选择素可以从细胞表面脱落下来成为血清中的可溶性粘附分子。本文通过 ELISA 方法定量分析了患者血清中的可溶性粘附分子ICAM-1 和 E-选择素，结果表明显著高于对照组。儿童的变应性鼻炎在发病状况方面与支气管哮喘有密切的相关性7 。提示鼻部疾病和哮喘可能具有共同的潜在发病基础，即由外源性变应原引起黏膜的过敏性炎症反应，可能累及以鼻腔黏膜为代表的上呼吸道黏膜和以支气管黏膜为代表的下呼吸道黏膜。Lundblad 曾提出过敏性鼻炎与支气管哮喘是同一种病的问题8 。
21、世界变态反应组织报道 32%的过敏性鼻炎患者可发展成支气管哮喘，50%的支气管哮喘患者伴发变应性鼻炎。由此提示，预防支气管哮喘要从治疗过敏性鼻炎入手，只有这样才能降低联合呼吸道过敏的发病。【参考文献】1 王莲芸，张克军，乔中东，等.花粉症患者血清可溶性细胞间粘附分子-1 检测.中华耳鼻咽喉科杂志，1999，34（4）：245-246. 2 Boldogh I， Bacsi A， Choudhury BK. ROS generated by pollen NADPH oxidase provide a signal that augments antigen-induced allergic a
22、irway inflammation. Clin Invest， 2005，115：2169-2179. 3 Fattouh R， Pouladi MA， Alvarez D，et al. House Dust Mite Facilitates Ovalbumin-specific Allergic Sensitization and Airway Inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine， 2005，172：314-321. 4 Silvestri M， Spallarossa D， Ba
23、ttistini E， et al. Changes in inflammatory and clinical parameters and in bronchial hyperreactivity asthmatic children sensitized to house dust mites following sublingual immunotherapy. J Investig Allergol Clin Immunol， 2002，12(1)：52-59. 5 王莲芸，林爱俊，乔中东，等.血清 sICAM-1 和 sVCAM-1 在支气管哮喘发病中的意义.中华微生物和免疫学杂志，2000，20（6）：558-559. 6 Bochner BS. Cellular adhesion and its antagonism. J
