1、甲磺酸胺银杏内酯 B 冻干粉针的大鼠胚胎胎仔发育毒性和遗传毒性实验研究作者：蔡鸣 王梦 于飞龙 闫英超 【摘要】 目的： 检测甲磺酸胺银杏内酯 B 的生殖毒性和遗传毒性。方法：甲磺酸胺银杏内酯 B 100、50、25 mgkg-1 于大鼠妊娠第 615天连续尾静脉注射给药，观察孕鼠饮水、摄食、生长等一般状况。每周称重 2 次，妊娠第 20 天处死孕鼠，记录各项检查结果。采用 Ames 试验、中国仓鼠肺成纤维细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验观察其遗传毒性。结果：供试品高、中、低剂量用药组母体未出现临床中毒症状。高剂量组和中剂量组吸收胎数、骨骼畸形与溶剂对照组相比有显著差异(P0.05)，低剂
2、量组与溶剂对照组相比未见统计学差异。各剂量组胎鼠身长、尾长和体重均未见明显改变(P0.05)。高剂量组中未见内脏畸形。供试品在每皿 505000 g 剂量范围内，未观察到回复突变菌落数明显增加。药物终浓度为 800、400、200gml-1 时，染色体畸变试验结果为阴性。小鼠静脉注射本品 260、130 和 65 mgkg-1 剂量，骨髓嗜多染红细胞微核数未见明显增加。结论： 在本试验条件下，甲磺酸胺银杏内酯 B 对大鼠母体一般状况和子代发育均安全的剂量为 25 mgkg-1；未见本品有潜在的遗传毒性。 【关键词】 甲磺酸胺银杏内酯 B 胚胎 胎仔发育毒性 遗传毒性 大鼠甲磺酸胺银杏内酯 B
3、冻干粉针的主要成分是甲磺酸胺银杏内酯B（dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate） ，化学名称为10O （N，N 二甲胺基乙基） 银杏内酯 B 甲磺酸盐。甲磺酸胺银杏内酯 B 是由银杏内酯 B 结构修饰而成的抗血小板活化因子的化学药物15 。其由于水溶性好，故做成冻干粉针，用于缺血性脑血管病急性发作期，已作为一类新药注册申报。为了保证供试品的安全使用，了解有无潜在的致畸作用，我们对其进行了大鼠的胚胎 胎仔发育毒性实验研究，同时采用常规遗传毒性试验方法，观察其是否具有潜在的遗传毒性。1 材料与方法1.1 药物甲磺酸胺银杏内酯 B 冻干粉针由江苏柯菲平医药有
4、限公司提供，规格为每瓶 40 mg；批号为 061001。实验时用 0.9氯化钠注射液稀释配成所需的受试药液。1.2 动物SPF 级 SD 大鼠，雌鼠 150 只（体重 210230g） ，雄鼠 75 只（体重 255280g） ，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号 SCXK(沪)20070003 ；清洁级 ICR 小鼠，雄性，6 周龄，体重 2226 g，合格证号 SCXK(苏)20020031 ，购自南京医科大学实验动物中心。动物房室温控制在 2026 ，相对湿度为 40%70%。所有孕鼠用全价颗粒饲料喂养，动物进入动物室后适应环境 1 周。组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌(S.Typ
5、himurium)TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535，上海市疾病预防控制中心提供；中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL） ，江苏省药品检验所提供。1.3 方法1.3.1 大鼠胚胎胎仔发育毒性试验 SD 大鼠按雄与雌 12 合笼，合笼时间 5 d，对雌鼠的阴道涂片进行显微镜检查，查见精子者定为妊娠 0 d。将孕鼠随机分为溶剂对照组、环磷酰胺（）阳性对照组以及甲磺酸胺银杏内酯高、中、低剂量组，每组 20 只。各组依次尾静脉注射(iv)5 mlkg-1 注射用生理盐水、2.8 mgkg-1 注射用和 100、50、25 mgkg-1 甲磺酸胺银杏内酯 B 冻干粉针，于妊娠 615 d
6、连续给药，每天 iv 给药 1 次，连续给药 10 d。每天观察孕鼠的摄食、饮水、生长等一般状况，于妊娠 0、3、7、10、13、16、20 d 称取体重。妊娠 20 d 处死孕鼠，记录黄体数、死胎数、着床数、吸收胎数、活胎数以及活胎体重、性别、外观异常等。约 1/2 胎仔固定于 Bouin 液作内脏检查，另 1/2 固定于 70%酒精作骨骼畸形检查。1.3.2 Ames 试验 试验采用 TA97、TA98、TA100、TA102、TA15355 株菌，标准平皿掺入法，在加 S9 和不加 S9 的平行条件下测试。试验浓度依次为每皿5000、2000、500、200、50 g。1.3.3 CHL
7、 染色体畸变试验 先测定 50生长抑制浓度(IC50)，根据 IC50 确定试验浓度为800、400、200gml-1。CHL 置培养瓶中培养 72 h 后换液，加入受试物。另设溶剂对照、阳性对照和空白对照组。阳性药分别为：-S9 即丝裂霉素(MMC，0.4 gml-1)和+S9 即 CP(20 gml-1)。加 S9 组另加0.5 ml S9 混合物，用 1640 培养液在 37 培养 6 h 后换液，继续培养18 h 收获细胞；不加 S9 组药物接触细胞 24 和 48 h 后收获细胞。在收获细胞前 4 h 加入秋水仙碱(0.2 gml-1 )。细胞经甲醇冰醋酸固定，Giemsa 染色。每
8、一剂量组观察 100 个中期分裂相细胞，记录细胞染色体的数目或结构异常，以百分率表示细胞畸变率。1.3.4 小鼠骨髓微核试验6 ICR 小鼠 50 只，随机分为 5 组，每组 10 只。小鼠静脉注射本品急性毒性 LD50 为 520.99 mgkg-1。小鼠微核试验剂量设为 260、130 和65 mgkg-1。另设生理盐水溶剂对照组和 CP 阳性对照组(40 mgkg-1)。小鼠静脉注射给药，每天给药 1 次，连续 3 d。末次给药后 24 h 采集股骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa 染色。在油镜下每只动物观察 2 000 个嗜多染红细胞(PCE)，记录含微核细胞数。同时观察 200 个嗜
9、多染红细胞(PCE)计数中见到的幼红细胞(NCE)数，计算 PCE/NCE 值。1.4 统计学处理孕鼠的体重、摄食量、黄体数、胎盘重，胎鼠的身长、尾长、体重，窝平均活胎数均用 t 检验；胎鼠的吸收率、死胎率及骨骼、脏器的畸形率、微核试验采用 2 检验。2 结 果2.1 对大鼠胚胎 胎仔发育的影响2.1.1 动物一般状况观察 给药期间对每只大鼠进行观察，未见流产、脱毛、窒息、厌食、共济失调、发绀、立毛、皮毛粗糙、惊厥、呼吸困难、鼻出血、凸眼、流泪、眼睛分泌物增多、活动过强、活动抑制、旋转、嗜眠、腹泻、粪便和尿液等排出物中带血或其他颜色等中毒症状。与溶剂对照组相比，高、中、低剂量甲磺酸胺银杏内酯
10、B 组孕鼠体重增加无显著差异(P0.05)。而 CP 组与溶剂对照组相比，13 d 以后体重增加明显抑制，体重增加幅度明显低于溶剂对照组，具有显著差异(P0.01 或 P0.05)。于妊娠 0、3、6、10、13、16、19 d 分别记录加食量，次日称取剩食量，计算耗食量，各剂量组与溶剂对照组相比无显著差异。CP 组在 13 d 耗食量明显低于溶剂对照组(P0.01)，其他时间无显著差异。2.1.2 甲磺酸胺银杏内酯 B 对胚胎形成的影响 母体检查结果见表 1。CP 组的活胎数、吸收胎数、黄体数、子宫总重及胎盘总重低于溶剂对照组，有统计学差异(P0.05 或 P0.001)。高剂量组和中剂量组
11、吸收胎数与溶剂对照组相比，有统计学差异(P0.05)，低剂量组与溶剂对照组相比未见统计学差异。CP 组和低剂量组分别有死胎 1 例，与溶剂对照组比，未见统计学差异。高、中、低剂量用药组与溶剂对照组相比，着床总数未见异常。2.1.3 甲磺酸胺银杏内酯 B 对胎鼠生长发育的影响 除甲磺酸胺银杏内酯 B 50 mgkg-1 组对胎鼠尾长有抑制(P0.05)外，与溶剂对照组相比，甲磺酸胺银杏内酯 B 其余剂量组对胎鼠身长、尾长和体重均未见明显影响 (P0.05)。CP 组则抑制胎鼠生长发育，对胎鼠身长、尾长、体重均有明显影响，与溶剂对照组相比有统计学差异(P0.001)。外观畸形发生率：CP 组除 2
12、 例无尾、1 例足内翻(P0.05)外，未见其他外观畸形发生(表 2)。2.1.4 甲磺酸胺银杏内酯 B 对胎鼠内脏和骨骼畸形的影响 采用胎鼠徒手切片法进行内脏检查，结果：除 CP 组出现腭裂 1 例、无眼 1 例、肾积水 3 例外，溶剂对照组和甲磺酸胺银杏内酯 B 高剂量组中未见内脏畸形，因此甲磺酸胺银杏内酯 B 中、低剂量组未作检查。甲磺酸胺银杏内酯 B 高剂量组的胸骨畸形(5 例子代胸骨骨化不全，18 例第5 胸骨节缺失)与溶剂对照组相比有显著差异(P0.001)；另有 5 例枕骨级骨化不全，与溶剂对照组相比无显著差异(P0.05)。中剂量组的胸骨畸形(3 例子代胸骨骨化不全，13 例第
13、 5 胸骨节缺失)与溶剂对照组相比有显著差异(P0.05)；另有 7 例子代枕骨骨化不全，与溶剂对照组相比无显著差异(P0.05)。低剂量组出现 1 例子代枕骨骨化不全，1 例子代胸骨骨化不全，4 例第 5 胸骨节缺失，与溶剂对照组相比无显著差异(P0.05)。组有 51 例子代枕骨骨化不全，部分枕骨只有两个较大的骨化点，30 例子代胸骨骨化不全，44 例第 5 胸骨节缺失，与溶剂对照组相比均有显著差异(P0.001)，另有 1 例肋骨 13 肋短小，1 例有 14 肋，与溶剂对照组相比无统计学差异。表 1 甲磺酸胺银杏内酯 B 对致畸敏感期妊娠母鼠的影响(略）表 2 甲磺酸胺银杏内酯 B 对
14、致畸敏感期胎仔生长发育及外观影响（略）2.2 对鼠伤寒沙门菌回复突变菌落数的影响甲磺酸胺银杏内酯 B 各剂量组平板背景菌苔正常。菌落计数表明，5 个剂量组中 TA97、TA98、TA100、TA102 和 TA15355 株菌，在加和不加 S9 条件下的回复突变菌落数未见剂量依赖性增加，各阳性对照组回复突变菌落数明显增加（表 3） 。因此，甲磺酸胺银杏内酯 B 对组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌无诱发回变作用。表 3 甲磺酸胺银杏内酯 B 的Ames 试验结果(略)2.3 对 CHL 染色体数目和结构的影响不加 S9 条件下，细胞接触甲磺酸胺银杏内酯 B 24 h，剂量为800、400 和 200
15、gml-1 时的细胞染色体畸变率依次为 0、1%和 2%。接触 48h 时，高、中和低 3 个剂量的细胞染色体畸变率依次为 1%、0 和 0，未呈现剂量依赖性增加。阳性对照组 24 和 48 h 的细胞染色体畸变率分别为 20%和 38%。加 S9 条件下，细胞接触同样剂量的甲磺酸胺银杏内酯6h，随后继续培养 18h，高、中和低剂量组的细胞染色体畸变率依次为2%、2%和 0，未呈现剂量依赖性增加。而阳性对照组的畸变率为 29%。因此，甲磺酸胺银杏内酯 B 的染色体畸变试验结果为阴性。2.4 对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的影响给药期间及给药结束观察，甲磺酸胺银杏内酯 B 各剂量组小鼠、溶剂对照组小
16、鼠和 CP 组小鼠外观及行为活动均未出现异常。经骨髓涂片微核计数，甲磺酸胺银杏内酯 B 各剂量组与对照组比较，微核率无明显差异，嗜多染红细胞与幼红细胞比例也未见明显改变（表 4） 。表 4 甲磺酸胺银杏内酯 B 小鼠骨髓微核试验结果（略）3 讨论银杏内酯 B 是中药银杏叶提取物的主要活性成分之一，可以抑制血小板聚集、抗炎、抗休克、保护心脑血管及治疗急性胰腺炎等，是治疗急慢性脑缺血疾病的有效药物4 。有报道显示，5 mgkg-1 银杏内酯 B 能降低大鼠血浆促炎因子含量, 提高 IL12 和细胞因子拮抗剂含量7 ，8、4 mgkg-1 银杏内酯 B 可明显减少三氯化铁致大脑中动脉血栓形成局灶性脑
17、缺血大鼠脑梗塞程度3 ；银杏内酯 B 10molL-1 对缺血 再灌注心肌损害具有明显的保护作用，其机制可能是拮抗 PAF 和抑制自由基的产生8 。因此，银杏内酯 B 有良好的临床应用前景。银杏内酯 B 化合物为白色结晶，水溶性极小，临床作为注射剂使用受到一定的限制。通过合成银杏内酯 B 衍生物(XQ)，解决了其水溶性低的问题，具有更高的生物利用度。实验表明，XQ 对 PAF、ADP、AA、COL 诱导的血小板聚集有抑制作用，其中对 PAF 诱导剂的作用强于银杏内酯 B，其作用机制可能与拮抗 PAF 受体有关9 。本研究从生殖毒理的角度研究甲磺酸胺银杏内酯 B 冻干粉针的潜在胚胎 胎仔发育毒性
18、及安全使用剂量，并检测其是否存在潜在的遗传毒性。本研究表明，甲磺酸胺银杏内酯 B 冻干粉针对母体一般状况和子代发育均安全的剂量为 25 mgkg-1，其剂量显著高于上述有效剂量。低剂量组虽有 1 例死胎出现，但并无统计学意义。在本实验室以往的实验中，空白对照组也偶有死胎出现，应属正常现象。遗传毒性 3 项试验即 Ames 试验、细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验结果均为阴性，说明在目前试验条件和剂量下，甲磺酸胺银杏内酯 B 无基因突变和染色体畸变作用，即无明显致突变性。随着对其药理及毒理学作用机制研究的深入，其临床应用范围不断扩大，可望成为一种具有开发前景的安全有效的药物。【参考文献】1秦引
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