1、碱性成纤维细胞生长因子对不同日龄大鼠癫疒间持续状态后海马神经发生的影响作者：戴园园 袁宝强 魏海燕 【摘要】 目的 了解不同年龄大鼠癫疒间持续状态后外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对海马齿状回颗粒细胞层神经发生的影响。方法 建立 14 天大鼠和 60 天大鼠戊四氮(PTZ)诱导癫疒间持续状态模型,生理盐水（NS）注射作为对照，皮下注射 bFGF 进行干预，分 4 组：NS 组、NS+ bFGF 组 、PTZ 组、PTZ+ bFGF 组。采用 Brdu 标记新生细胞，免疫组化方法检测造模后大鼠海马齿状回神经发生情况，造模后第 7、14 天 2个时间点观察海马齿状回 Brdu 阳性细胞数。
2、结果 造模后第 7 天和 14 天,PTZ 组中各日龄组大鼠海马齿状回 Brdu 阳性细胞数明显高于各自对应的NS 组(P0.01),NS+bFGF 组各日龄大鼠 Brdu 阳性细胞数亦高于 NS 组(P0.05), PTZ+bFGF 组 Brdu 免疫阳性细胞数较 PTZ 组亦有升高(14天日龄组 P0.05,60 天日龄组 P0.01)。60 天大鼠较 14 天大鼠升高幅度更为明显(P0.01)。结论 bFGF 可增加癫疒间持续状态大鼠海马齿状回颗粒细胞发生,对 60 日龄大鼠比 14 日龄幼鼠更为明显。 【关键词】 癫疒间持续状态 碱性成纤维细胞生长因子 神经发生 齿状回 Abstrac
3、t: Objective To study the neurogenesis of hippocampal dentate gyrus granular cell layer in different-age rats with induced status epilepticus and its response to ectogenic basic fibroblast growth factor (bFGF). Methods Pentetrazole (PTZ) was used to form status epilepticus model on 14-day and 60-day
4、 old rats. The experiment was carried out in four groups, with the results analysed 7 days and 14 days after treatment. Brdu labeled new cells were counted to describe the neurogenesis in dentate gyrus. Results 7 days and 14 days after treatment, Brdu positive cells in the dentate gyrus were more nu
5、merous in the PTZ group and the NS+bFGF group than in the NS group, more numerous in the PTZ+bFGF group than in the PTZ group (P0.01, P0.05）. The increment was more marked in the 60-day-old rats than in the 14-day-olds. Conclusion Basic fibroblast growth factor can promote neurogenesis in the hippoc
6、ampus dentate gyrus granular cell layer in rats with status epilepticus, and the change is more marked in the elder rats than in the younger. Key words: status epilepticus; basic fibroblast growth factor; neurogenesis; dentate gyrus 癫疒间是神经系统常见疾患，发作后海马齿状回可发生多种可塑性变化，包括轴索重组、星形胶质细胞活化、树突重组和颗粒细胞的神经发生(neur
7、ogenesis)等。神经发生是指包括人在内的大多数哺乳类动物均存在的神经系统产生新神经元的过程。近年来，已有研究证实癫疒间发作后海马齿状回颗粒细胞层的神经发生增加12 。海马齿状回颗粒细胞层的神经发生受到多种生长因子和神经营养因子的调控，其中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是较重要的一种。本试验即给予外源性 bFGF 皮下注射，探讨 bFGF 是否促进大鼠癫疒间发作后海马齿状回颗粒细胞层神经发生，并探讨年龄因素对于癫疒间发作后这一可塑性变化有无影响。 1 材料和方法 1.1 动物及分组 生后 14 天和 60 天的 SD 大鼠
8、 ，分别随机分为癫疒间持续状态组（PTZ 组） 、 生理盐水组（NS 组） 、 bFGF 干预癫疒间持续状态组（PTZ+ bFGF）和 bFGF 干预生理盐水组（NS+ bFGF 组） 。 1.2 模型的建立 PTZ 组和 PTZ+ bFGF 组给予腹腔内注射 1戊四氮(PTZ，Sigma 公司) 80 mg/kg, 用双蒸水稀释成 10 g/L,腹腔注射；NS组、NS+ bFGF 组给予腹腔注射等体积生理盐水。NS+ bFGF 组和 PTZ+ bFGF 组在注射戊四氮或生理盐水前 2 h 皮下注射 bFGF（Sigma 公司）20 g/kg （用生理盐水稀释成 1 mg/L） 。PTZ 组和
9、 PTZ+bFGF 组中除去无发作和死亡者，每组入组 6 只。 参照 Racine 癫疒间发作分级标准3:0 级,无任何发作;1 级,口、面部抽搐;2 级,节律性点头样运动;3 级,前肢阵挛;4 级,前肢阵挛伴后肢站立;5 级,反复的 4 级发作或抽搐致死。PTZ 组和 PTZ+ bFGF 组入组大鼠均达到 35 级发作，持续 30 min 以上，发作间期意识无清醒，呈癫疒间持续状态。发作 1 h 以上者给予地西泮 4 mg/kg 腹腔注射中止发作。 1.3 Brdu 注射 Brdu（Sigma 公司）溶于生理盐水，浓度 10 g/L。注射戊四氮或生理盐水后第 6、13 天各组经腹腔注射 Br
10、du，剂量为 50 mg/kg,每 2 h 1 次，共 4 次。 1.4 组织切片制备 各组分别于注射 Brdu 后 24 h 腹腔注射 10水合氯醛（0.35 ml/kg）麻醉。生理盐水快速灌注后，含 4多聚甲醛的PBS 先快速灌注再缓慢灌注，直到大鼠肝脏变白、尾变硬,停止灌注。开颅,取嗅脑至中脑之间的脑组织,放入 4%多聚甲醛固定 12 h 以上,然后依次移入 20%和 30%蔗糖中 4过夜至沉底。在海马部位做冠状冰冻切片,每隔 2 张取 1 张切片,每例标本(双侧海马结构)取切片不少于 8 张,进行免疫组化染色。 1.5 Brdu 免疫组化 应用 SP 免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物公
11、司）, 按以下步骤处理:脑片入新配制的 0.1%H2O2 溶液中室温下孵育30 min 以灭活内源性过氧化物酶 ; 入 2 mol/L HCl 溶液中，37 浸泡60 min 使 DNA 变性，再用 0.1 mol/L 硼酸缓冲液(pH 8.5)室温下浸泡 10 min 用以中和盐酸；然后以鼠抗尿嘧啶脱氧核苷单克隆抗体（1100，北京中杉金桥生物公司）作为一抗， 采用 SP 法行 Brdu 免疫组织化学染色，用 DAB 和 H2O2 呈色， 自来水冲洗， 贴片、 脱水、 透明、 封片。 胞核棕黄色为阳性细胞。 1.6 图像分析 切片置于 Olympus PM-CB 显微镜下观察,在高倍镜下观察
12、整片大鼠海马齿状回颗粒细胞层(GCL)、亚颗粒增生带(SGZ,CL 与门区之间约 2 个细胞体厚的 1 层)及门区的 Brdu 阳性细胞数,每只大鼠随机取 56 个非连续脑片进行计数，取平均值。 1.7 统计学处理 数据由 SPSS 11.5 统计软件处理，xs 表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）及 t 检验，检验水准：=0.05。 2 结 果 2.1 行为学观察 PTZ 组、PTZ+bFGF 组：注射戊四氮后经过 14 min 的潜伏期，大鼠由自由活动状态逐渐转为安静，眼神呆滞，出现咀嚼运动、流涎、扒地、搔抓动作，双后肢分开站立，继之进入大发作期，出现前肢痉挛、狂奔，跳跃、嘶叫、
13、头偏向一侧及全身阵发性抽动；部分动物表现为摔倒、翻滚等全身强直阵挛性发作，同时伴有喉鸣、肢端青紫等。入组动物发作均超过 30 min，发作超过 1 h 者经注射地西泮后逐渐缓解。发作停止后，动物经约 1 h 安静状态后活动渐恢复。 NS 组、NS+bFGF 组：无任何发作迹象和抽搐表现，行为正常。 2.2 碱性成纤维细胞生长因子对海马神经发生的影响 造模后第 7天和第 14 天，2 个日龄组中 NS+bFGF 组 Brdu 阳性细胞数较各自 NS 组增多（P0.05） ，PTZ 各组日龄的大鼠 Brdu 阳性细胞数明显高于各自的NS 组（P0.05） ，同时 PTZ+bFGF 组较 PTZ 组
14、亦明显升高（P0.05） 。造模后第 7 天，4 组大鼠的大部分 Brdu 阳性细胞分布于颗粒细胞下层(图 1A、C)；第 14 天，新生细胞在 PTZ 组和 PTZ+bFGF 组除分布于颗粒细胞层外，另有一部分迁移到门区和内分子层（图 1B、D） 。而在 NS 组和NS+bFGF 组，Brdu 阳性细胞主要分布于整个颗粒细胞层（图 1E） 。 新生细胞在由颗粒下层向颗粒细胞层迁移的 过程中， 胞核变大， 形状更接近圆形或卵圆形（图 1F） 。 图 1 大鼠海马齿状回 Brdu 免疫反应产物(SP 法) A：PTZ 组发作后 7 天，Brdu 阳性细胞大部分分布在颗粒细胞下层（100） ； B
15、： PTZ 组发作后 14 天, Brdu 阳性细胞除大部分布于颗粒细胞层外，还有部分分布在门区和内分子层（100） ；C：PTZ+ bFGF 组处理后 7 天，Brdu 阳性细胞大部分分布在颗粒细胞下层（100） ；D：PTZ+ bFGF 组处理后 14 天，Brdu 阳性细胞除大部分布于颗粒细胞层外，仍有部分分布在门区和内分子层（100） ；E： NS+bFGF 组处理后14 天, Brdu 阳性细胞主要分布于整个颗粒细胞层（100） ；F：Brdu 阳性细胞（400） 。表 1 不同日龄大鼠各组齿状回 Brdu 阳性细胞数比较 3 讨 论 1992 年，Reynold 和 Weiss 证
16、明成年哺乳动物的大脑内存在有神经发生现象2 ，主要部位在侧脑室下区和海马，海马齿状回下颗粒层增生带的祖细胞可以在细胞层和门区的边界增殖后迁移到颗粒细胞层并分化为成熟神经元。在动物实验中, 化学致惊剂诱导的颞叶癫疒间或是癫疒间持续状态所致的齿状回细胞增殖至少要经过数天的潜伏期，而神经元发生的高峰通常在癫疒间发作后 1 周左右4 。我们前期的实验已证明幼鼠癫疒间持续状态后海马齿状回细胞有显著的神经发生现象，这种神经元生成增加提示在损伤部位可能有代偿作用5 。 神经细胞的增殖和新生神经元的存活受到许多因素的影响,包括年龄、激素水平及多种生长因子等。其中 bFGF 对于脑损伤后的修复作用正受到越多学者
17、的关注。 bFGF 长期以来一直被认为是一种神经胶质细胞有效的有丝分裂原，能改善神经细胞的生长过程， bFGF 可以改善海马结构、脑皮质、小脑的颗粒层神经细胞的存活和生长。在正常状态下,海马有一定的 bFGF 基础表达，癫疒间发作后脑内海马区 bFGF 表达显著增加6 ，提示中枢神经系统损伤局部环境存在自我修复，但这种因素短暂而不稳定。体内 bFGF 含量极微，病理情况下，内源性 bFGF 作用有限，外源性bFGF 可以及时补充内源性 bFGF 的不足，早期应用可限制神经元损害的扩大。体内外实验证明，bFGF 可以通过血脑屏障进入神经系统7,并且 bFGF 在生物进化上有很强的保守性，人和牛
18、bFGF 氨基酸顺序同源性达98.7，这为临床利用外源性 bFGF 进行替代补充治疗提供了基本依据。 有实验显示，在胎儿海马 C3 区移植物进行移植替代癫疒间持续状态后丢失的神经元时，经过 bFGF 预处理的细胞存活时间延长，且和成年海马显示出较好的整合作用并减轻了异常的苔藓纤维发芽8 。Zucchini 等9应用红藻氨酸点燃模型发现小鼠癫疒间发作后 bFGF mRNA 和蛋白的水平在某些脑区升高，给予侧脑室注射低剂量 bFGF 可以减轻海马的损伤,促进行为的恢复。 本实验对大鼠年龄的选择基于人脑和大鼠脑发育程度的对应关系。普遍认为:14 天大鼠的脑发育程度与 1 岁儿童相当,而生后 60 天
19、鼠脑的发育基本成熟。 虽然齿状回的神经干细胞具有终身分化的能力，但随着年龄的增加，细胞的增殖能力减弱。本实验亦显示，NS 组中 14 天幼鼠海马的神经发生现象较 60 天大鼠显著，bFGF 对 14 天幼鼠和 60 天成年大鼠海马齿状回颗粒细胞层的神经发生均有促进作用，但对 60 天大鼠促进作用更明显。在癫疒间发作大鼠组中， bFGF 干预后 1 周后，14 天大鼠的海马齿状回神经发生较 PTZ 组增加了 7，而 60 天大鼠则增加了 20。这一结果显示成熟大脑对于 bFGF 的促神经发生作用有着更高的敏感性。Jin 等10 的实验发现，给予注射 bFGF 后，20 个月的小鼠 SGZ 区Br
20、du 阳性细胞数增加了 250，说明年老的大脑对外源性 bFGF 仍有着非常敏感的反应。据研究，大鼠出生 2 周内脑内 bFGF 较低，仅为成鼠的2011 ，故而推测 14 天幼鼠脑内 bFGF 受体亦未发育完全或受体数量相对较少而造成这种差异。具体机制尚待进一步探讨。 bFGF 促进大鼠海马齿状回的神经发生机制尚不十分明确,可能和以下有关:bFGF 诱导及促进神经前体细胞细胞核有丝分裂12,调节神经元前体细胞端粒酶活性13,调控钙调蛋白基因、血小板凝血酶敏感蛋白 1 基因、特异性成骨细胞因子 2 基因和细胞因子诱导的核蛋白的表达14 。 癫疒间发作后存在神经细胞丢失，严重癫疒间发作后脑部的病
21、理损害可累及多个脑区，其中海马区的细胞减少密度最为明显，损伤区周围的星形胶质细胞被激活，能够产生包括 bFGF 在内的各种细胞生长因子和神经营养因子，有利于神经元的生存和轴突再生，但保护作用是有限的。当脑损伤较重，或损伤时间长，保护作用则相对较弱。我们的实验采用了癫疒间持续状态模型，虽然癫疒间大鼠发作后神经元增殖增加，但仍逊于 bFGF 干预的癫疒间大鼠，这就提示内源性 bFGF 等因素所致的增殖代偿能力是有限的。外源性加入 bFGF 改变细胞再生环境，调控星形胶质细胞至一个恰当的状态，创造出一个有利于神经功能恢复的微环境。 严重的癫疒间发作会出现认知功能障碍，尤其在儿童，而神经发生现象和空间
22、的学习、记忆能力有密切关系。bFGF 在脑损伤后是一种极其重要的调节海马神经发生的因子。在脑损伤后给予外源性生长因子可以提供一个治疗方面的策略。 【参考文献】 1 Parent JM. Injury-induced neurogenesis in the adult mammalian brain. Neuroscientist，2003，9(4):261-72. 2 Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolate cells of the adult mammalian central nervo
23、us systemJ.Science,1992,255(5052):1707-1710. 3 Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation: cortical areasJ. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1975,38(1):1-12. 4 Jiang W, Wan Q, Zhang ZJ, et al. Dentate granule cell neurogenesis after seizures induced by pentylenetrazol
24、 in rats. Brain Res，2003, 977(2):141-148. 5 陈 静, 袁宝强. 戊四氮诱导发育鼠癫疒间持续状态后海马神经发生及 MK-801 的影响J. 中国当代儿科杂志, 2006,8(5):421-424. 6 张广慧, 张龙轩, 朱遂强,等.碱性成纤维细胞生长因子在癫疒间大鼠海马中的表达J. 中国康复,2005,20(5):267-269. 7 Wagner JP, Black IB, DiCicco-Bloom E. Stimulation of neonatal and adult brain neurogenesis by subcutaneous in
25、jection of basic fibroblast growth factor . J Neurosci, 1999, 19(14):6006-6016. 8 Rao MS, Hattiangady B, Shetty AK. Fetal hippocampal CA3 cell grafts enriched with FGF-2 and BDNF exhibit robust long-term survival and integration and suppress aberrant mossy fiber sprouting in the injured middle-aged
26、hippocampus J . Neurobiol Dis, 2006,21(2):276-290. 9 Zucchini S, Barbieri M, Simonato M. Alterations in seizure susceptibility and in seizure-induced plasticity after pharmacologic and genetic manipulation of the fibroblast growth factor-2 systemJ. Epilepsia, 2005,46(Suppl 5):52-58. 10 Jin K, Sun Y,
27、 Xie L, et al. Neurogenesis and aging: FGF-2 and HB-EGF restore neurogenesis in hippocampus and subventricular zone of aged miceJ. Aging Cell, 2003,2(3):175-183. 11 Julliard A, Hartmann D. Spatiotemporal patterns of expression of extracellular matrix molecules in the development and adult rat olfact
28、ory systemJ. Neuroscience,1998,84(4):1135-1150. 12 Ortega S, Ittmann M, Tsang SH, et al. Neuroral defects and delayed wound healing in mice lacking fibroblast growth factor 2J. Proc Nail Acad Sci USA,1998, 95(10):5672-5677. 13 Miyasaka N, Matsuoka I. Identidication of basic fibroblast growth factor-responsive genes by mRNA-differential display in an immortalizd neural stem cell line J . Biol
