1、睫状神经营养因子单克隆抗体制备关键字： 睫状神经 睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factorCNTF)是从鸡胚睫状神经节中提取出来的一种神经营养蛋白1 ，在体内有广泛的生理功能，在病理条件下对机体的神经功能修复也具有重要作用，目前已展开 CNTF临床应用的研究。但 CNTF还存在许多未知领域，我们希望能通过制备 CNTF单克隆抗体，为今后深入探讨 CNTF的结构、功能和作用机制创造条件。 1 材料和方法 1. 1 动物与细胞 BALB/c 小鼠（上海马普尔-必凯实验动物中心） ；SP2/0骨髓瘤细胞（上海第二医科大学医学检验重点实验室） 。 1.2 主要试剂与器材
2、 完全及不完全福氏佐剂、RPMI 1640 培养基、8-氮鸟嘌呤、 次黄嘌呤、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶（HATSigma 公司） ；新生牛血清（杭州四季青生物试剂公司） ；胎牛血清（Gibco 公司） ；聚乙二醇（Mr3700，Merck 公司） ；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG（效价1104， Calbiochem公司） ；邻苯二胺、底物缓冲液（上海第二医科大学医学检验重点实验室） ；抗血清标准品IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA（DAKO 公司） ；细胞培养板（Nunc公司） ，酶联检测仪（BIO-RAD 公司） 。 1.3 抗原制备 CNTF 系用重组 DNA技术构建
3、的人 CNTF质粒，在大肠杆菌中表达，经离子交换交联葡聚糖层析和分子筛层析方法纯化后得到的重组蛋白，含 200个氨基酸 相对分子质量 22 000，神经营养比活性为 1.3 IU/ng，纯度大于 95%2 。 1.4 杂交瘤细胞株的建立、杂交瘤细胞染色体核型分析、体内诱生获取单克隆抗体、抗体效价测定和 IgG类型及亚类鉴定 采用文献3所述方法。 1.5 CNTF 单克隆抗体特异性鉴定 取 SD大鼠脑组织冰冻切片，用含 CNTF单克隆抗体的杂交瘤细胞腹水进行免疫组化染色，设 SP2/0骨髓瘤细胞腹水作阴性对照。 1.6 对 CNTF功能的影响 体外培养新生 SD大鼠骨骼肌细胞，传代至 96孔细胞
4、培养板(每孔 3 000个细胞)，每行为 1组，分空白组、对照组、CNTF 组、CNTF-单克隆抗体 B9(CNTF-B9)组、CNTF-单克隆抗体E7(CNTF-E7)组和 CNTF-SP2/0组。24 h后，CNTF 组给予 CNTF 15 g/ml，CNTF-B9 组给予 CNTF 15 g/ml 和 10% B9鼠腹水，CNTF-E7 组给予 CNTF 15 g/ml 和 10% E7鼠腹水，CNTF-SP2/0 组给予 CNTF 15 g/ml 和 10% SP2/0鼠腹水，各组每孔培养液总量 200 l，空白组和对照组添加等量培养液。72 h后结晶紫染色，酶联仪测定 490 nm光
5、密度值(D)。 1.7 统计学处理 数据以 Xs表示，采用 t检验。 2 结 果 2.1 细胞融合率及抗体阳性率 融合后细胞共制备了 5块 96孔细胞培养板，细胞融合率平均为 62%。间接 ELISA法检测克隆孔培养上清，抗体阳性率为 40% ；有限稀释板第 1次为 15%，第 2次为 98%，第 3次为100% 。 2.2 杂交瘤细胞染色体核型 经过细胞融合、筛选、克隆化和扩增培养后，获得 G9、B9、F9、E7、E8 5 株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。这 5株细胞的染色体分析发现，分裂相中均有中部着丝点、亚中部着丝点等 SP2/0骨髓瘤细胞染色体标记，亦有小鼠脾细胞端着丝点染色体标记，杂交
6、瘤细胞染色体 2n=84110平均 94，符合小鼠脾细胞与 SP2/0骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的核型特点。 2.3 抗体效价 设 SP2/0骨髓瘤细胞培养上清、腹水及血清作阴性对照，以 D值阴性对照平均 D值2S 者为阳性标准，出现阳性的最高稀释倍数为该腹水或血清的效价。杂交瘤细胞的培养上清抗体效价为1104 左右；腹水抗体效价为 11071108；小鼠血清抗体效价为1106。 2.4 单克隆抗体 Ig类型 经琼脂免疫双相扩散法测定，杂交瘤细胞腹水中的抗体均为 IgG2a类。 2.5 单克隆抗体的特异性 杂交瘤细胞腹水能清晰地显示 SD大鼠脑内分泌 CNTF的神经元，但对其它神经元无显色反
7、应；而 SP2/0骨髓瘤细胞腹水处理的脑组织切片无神经元着色(图 2)。表明所制备的单克隆抗体具有 CNTF特异性。 2.6 单抗对 CNTF功能的影响 如图 3所示(D 值越大，表示细胞数量越多)：CNTF 组、CNTF-SP2/0 组和 CNTF-B9组，细胞数量均明显多于对照组和 CNTF-E7组(P0.01)；CNTF-E7 组细胞数量明显多于对照组(P0.01)。表明 CNTF可以促进体外培养的新生 SD大鼠骨骼肌细胞增殖，E7细胞株产生的 CNTF单克隆抗体可抑制该功能，而 B9细胞株产生的CNTF单克隆抗体和 SP2/0骨髓瘤细胞腹水对 CNTF功能无明显影响。 3 讨 论 CN
8、TF 广泛分布于神经系统，具备多种生物学功能：促进前体神经元生长、分化和成熟，维持各种神经元存活，促进损伤神经元再生修复，阻止神经元退行性变化，保护神经胶质细胞等46 。但是 CNTF尚有许多未知领域：其基因调控元件还不十分清楚，释放机制还是一个谜， 高级结构尚无试验研究，具体信号传导过程尚不清楚，CNTF 合成与代谢、生理功能及在病理状态下的作用等都还未完全认识。应用 CNTF 单克隆抗体，可以更精确地分析 CNTF及其受体的结构和分布，研究它们的基因表达、调控与信号传导，更可靠地检测它们的含量，动态观察 CNTF的体内代谢和执行生物功能的情况等，为深入了解 CNTF的结构、功能和代谢提供了一个极为有用的工具。 本实验所制备的单克隆抗体，能清晰地显示 SD大鼠脑内分泌 CNTF的神经元，而对其他神经元无显色反应，表明其具有良好的特异性，为有针对性地进行 CNTF的研究提供了有利条件。 不同细胞株产生的单克隆抗体，对 CNTF促进体外培养新生 SD大鼠骨骼肌细胞增殖功能的影响不同，其中一株可明显抑制该功能，而另一株对该功能无影响，表明不同细胞株产生的抗体是来自不同的抗原决定簇的，使我们可以从不同角度研究 CNTF，更增加了其可用性。
