1、碱性成纤维细胞生长因子及内皮细胞生长因子对兔韧带细胞增殖的影响【摘要】 目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和内皮细胞生长因子(ECGF)对内侧副韧带(MCL)和前十字韧带(ACL)细胞增殖行为的影响。方法 培养 10 周龄新西兰白兔内侧副韧带和前十字韧带细胞，在培养液中分别加入 bFGF 和 ECGF，以 XTT 方法测定细胞的增殖行为。 结果 bFGF在 1 ng/ml 时即对 MCL 细胞有显著的促增殖作用，5 ng/ml 时开始对 ACL细胞有促进作用，其浓度达 50 ng/ml 时，对两种细胞的促进作用最大。ECGF 在 3.125 ng/ml 时即对 MCL 细胞有显著的促
2、增殖作用，其浓度达12.5 ng/ml 时对 ACL 细胞有促进作用。bFGF 和 ECGF 在超过其最佳作用浓度后，随浓度升高促进作用不再增强。结论 bFGF 和 ECGF 可以促进韧带细胞增殖进而促进韧带创伤愈合。 【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子;内皮细胞生长因子;韧带;细胞增殖 【Abstract】 Objective To observe the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) and endothelial cell growth factor (ECGF) on the proliferation of the
3、cells from medial collateral ligament (MCL) and anterior cruciate ligament (ACL).Medthods The MCL and ACL cells of tenweekold skeletally immature New Zealand white rabbit were cultured, while bFGF and ECGF were added to the cell culture media, the cellular proliferation was assayed by XTT method.Res
4、ults The addition of 1 ng/ml bFGF enhanced the proliferation of MCL cells significantly, 5 ng/ml bFGF enhanced the proliferation of ACL cells ,this enhancement of proliferation of both MCL cells and ACL cells was maximal in the concentration of 50 ng/ml. The adition of 3.125 ng/ml ECGF enhanced the
5、proliferation of MCL cells significantly, 12.5 ng/ml ECGF enhanced the proliferation of ACL cells.The efficacy of bFGF and ECGF declined gradually when they present at concentrations greater than the dose with the greatest efficacy.Conlusion It is evident that bFGF and ECGF can enhance the prolifera
6、tion of the ligamentous cells and they can enhance the healing of ligamentous issue injuries. 【Key words】 bFGF, ligament,proliferation,ECGF 韧带损伤是膝部的常见运动创伤，尤以内侧副韧带(medial collateral ligament,MCL)和前十字韧带(anterior cruciate ligament,ACL)多见，MCL 和 ACL 是维持膝关节稳定的重要韧带，其损伤可使膝关节丧失稳定性，引起功能障碍，甚至导致骨关节炎21。在中央实质部完全断
7、裂后，MCL 可自然愈合，有时不需手术介入;而 ACL 损伤后，即使手术缝合断端，其愈合率也较低。韧带损伤后的愈合过程与一般结缔组织相似，都经过急性炎症期、修复再生期和重塑或成熟期三个阶段2。研究表明3，在损伤韧带的局部存在着多种生长因子，它们被认为是韧带正常愈合过程的重要调节者。使用生长因子促进韧带愈合是近年来研究的焦点之一。作者通过体外培养 MCL 和 ACL 细胞，分别加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和内皮细胞生长因子(ECGF)，以观察bFGF 和 ECGF 对韧带细胞增殖的影响，为应用 bFGF 和 ECGF 促进韧带创伤愈合提供依据。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 bFG
8、F(暨南大学生物医学工程研究所惠赠)，ECGF(Sigma 公司产品，美国)，DMEM 培养基及胰蛋白酶(Gibco 公司产品)，胶原酶、XTT(Sigama 公司，美国)，胎牛血清(杭州四季青生物有限公司),酶标仪(日本 Reader)。 1.2 内侧副韧带和前十字韧带成纤维细胞培养 无菌切取兔龄 10 周新西兰白兔 MCL 和 ACL，在含 100 g/ml PG 和 100 g/ml SM 双抗Hanks 液中剔除滑膜等外周组织，以眼科剪剪成 1 mm3 左右的碎片。配制 0.25%的胶原酶，将韧带组织移至胶原酶液中，37条件下消化12 h，组织消化后，无血清 DMEM 培养液冲洗，离心
9、，以含 15%胎牛血清的 DMEM 培养液悬浮细胞，接种于一次性塑料培养瓶(Corning 公司，美国)中，置于 37、体积分数为 5%CO2 培养箱内培养。每 3 d 换液一次，待细胞汇合后，以胰蛋白酶消化传代。 1.3 XTT 法测定韧带细胞增殖 收获第 25 代的 MCL 和 ACL 细胞，以5103/孔的浓度，接种于 96 孔培养板上，待细胞贴壁后，分别加入1、5、10、50、100 及 500 ng/ml 的 bFGF 和3.125、6.25、12.5、25、50 及 100 ng/ml 的 ECGF。对照组不加 bFGF 和ECGF。每组四个复孔。CO2 培养箱内培养，每天观察一次
10、。培养 3 d 后，每孔加入 50 l XTT(1 mg/ml)。在 37、5%CO2 培养箱内继续孵育，3 h 后，在酶标仪上比色(参考波长 650 nm,测量波长 450 nm)，读取 OD 值。1.4 统计学处理 实验所得数据以 SPSS11.0 统计软件进行分析，用方差分析和 Dunnett 法检验，=0.05。 2 结果 2.1 膝关节韧带细胞培养 膝关节韧带细胞贴壁时间约 56 d，体外培养条件下，ACL 细胞的增殖速度明显慢于 MCL 细胞;ACL 细胞原代生长约需 1315 d，MCL 细胞原代生长约需 1113 d。12 传代的细胞不超过 6 代时，基本上能在 57 d 内汇
11、合成单层。ACL 与 MCL 细胞贴壁生长，形态呈梭形，与典型的成纤维细胞形态相似(图 1、2)。 图 1 原代培养兔 ACL 细胞(100) 图 2 原代培养兔 MCL 细胞(100) 2.2 bFGF 对兔韧带成纤维细胞增殖的影响 表 1 可见，MCL 和 ACL 各实验组 OD 值均大于对照组，经统计学检验，ACL 各组 OD 值方差分析，F=28.02，P0.01;各实验组与对照组比较，1 ng/ml 组P0.05，5 ng/ml 各组 P 均0.01。MCL 各组 OD 值方差分析，F=90.66，P0.01;各实验组与对照组比较均为 P0.01。表明 bFGF对 MCL 和 ACL
12、 细胞的增殖均有促进作用。1 ng/ml bFGF 即可促进 MCL 细胞生长，5 ng/ml bFGF 即可促进 ACL 细胞生长。bFGF 浓度高至 50 ng/ml 时，其促进作用达到最大值;超过其最佳作用浓度后，随浓度升高促进作用不再增强(P0.05)。 2.3 ECGF 对兔韧带成纤维细胞增殖的影响 表 2 可见，MCL 和 ACL 各实验组 OD 值均大于对照组，经统计学检验，ACL 各组 OD 值方差分析，F=3.82，P=0.01;各实验组与对照组比较，12.5 ng/ml 各组 P 值均0.05。MCL 各组 OD 值方差分析，F=136.06，P0.01;各实验组与对照组比
13、较均为 P0.01。表明 ECGF 对 MCL 和 ACL 细胞的增殖均有促进作用。3.125 ng/ml ECGF 即可显著促进 MCL 细胞生长，浓度在 12.5 ng/ml 时，其促进作用达到最大值;超过其最佳作用浓度后，随浓度升高促进作用不再增强(P0.05)。 表 1 bFGF 对兔韧带细胞增殖的影响表 2 ECGF 对兔韧带细胞增殖的影响 3 讨论 bFGF 和 ECGF 是一些具有生物活性的多肽，具有趋化性、促有丝分裂和促进胞外基质合成的作用。它们可与细胞表面特异性受体结合，产生第二信使;第二信使可使细胞核根据特定的基因诱导或抑制基因组 DNA 向mRNA 的转录，改变某些蛋白质
14、的水平，进而促进 DNA 的复制和有丝分裂。有研究表明4，5,在韧带损伤的前两周内内源性生长因子的量和生长因子受体数目是增多的。用 RTPCR 技术在分子水平揭示生长因子及其受体的 mRNA 转录增加，故在韧带损伤的早期生长因子合成增加3。同样在韧带的创伤愈合过程中，存在 bFGF 的调节作用6。组织学观察证实，在韧带修复过程中成纤维细胞的增殖是第一步7。Schmidt 等6报道 bFGF 在某一浓度范围内均可促进 MCL 和 ACL 细胞的 DNA 合成。Scherping 等8报道应用大剂量的 bFGF，对 ACL 成纤维细胞的增殖有很强的促进作用。张堂德等9报道，ECGF 能够同时促进内
15、皮细胞和成纤维细胞分裂、增殖，他们的研究同时表明，ECGF 对内皮细胞及成纤维细胞的作用有一个最适浓度，高于或低于最适浓度，细胞的增殖能力均会降低。笔者通过培养膝关节韧带成纤维细胞，分析了外源性 bFGF、ECGF 对韧带成纤维细胞增殖的影响，实验表明 bFGF 和 ECGF 对兔 MCL 和 ACL 细胞具有明显的促有丝分裂活性;在某一浓度范围内对细胞增殖的影响与因子的浓度有依赖性，超过其最佳作用浓度后，增加因子的浓度，细胞增殖不再增加。以上证实 bFGF、ECGF 可以促进韧带成纤维细胞增殖。bFGF和 ECGF 对韧带细胞作用的量效关系和峰值浓度不一致，可能与 MCL 和ACL 细胞的不
16、同生物学特性有关。生长因子的双相性可能与肽链受体之间的亲和力有关，少量的细胞因子可在细胞膜上结合高亲和力的受体，产生链式反应，如细胞增生及合成蛋白质;而大量的细胞因子会结合更多低亲和力的受体，不能产生新的细胞甚至起相反的作用10。 由于韧带损伤局部存在多种生长因子，生长因子之间的相互作用还需进一步探讨。 近年来，随着组织工程学研究的兴起，研究人员尝试将膝关节韧带细胞与其它材料结合起来，制成具有生物活性的人工韧带。而在这种活性材料中，细胞的增殖将是十分关键的问题。如何将生长因子如bFGF、ECGF 等与这些材料结合起来，也将是研究者感兴趣的问题。因而将 bFGF、ECGF 等应用于韧带组织工程学
17、中，以修复韧带损伤的应用前景也将是十分广阔的。 【参考文献】 1 Kannus P, Jarvinen M. Posttramatic anterior cruciate ligament insufficiency as a cause of osteoarthritis in a knee jointJ.Clin Rheumatol, 1989, 8(2): 251260. 2 Freddie HF, Hamer CD, Johnson DL,et al.Biomechanics of knee ligaments: Basic concepts and clinical applicat
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