1、睫状神经营养因子和雪旺细胞神经营养活性物质对大鼠视神经损伤后轴突数的影响【关键词】 眼损伤 关键词: 眼损伤;视神经;睫状神经营养因子;雪旺细胞神经营养活性物质;大鼠 摘 要:目的 观察睫状神经生长因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）和雪旺细胞神经营养活性物质（Schwann cells neurotrophic agent，SCNA）对视神经损伤后轴突的形态和纤维数目变化的作用. 方法 采用镊夹法制作大鼠视神经损伤模型，损伤后立即一次性向玻璃体内注射 CNTF（50ng）或 SCNA（10L） ，在损伤后 1，2，3和 4wk 时观察夹伤视神经的形态，及进
2、行图像分析和轴突纤维计数. 结果 损伤后视神经轴突减少，间质增多.CNTF 组和 SCNA 组的轴突数密度在 1wk 时分别为正常值（0.10650.0056 个m-2 ）的 0.59和 0.61，而对照组为 0.55，实验组与对照组比较差异显著（P0.05）.但在夹伤 2wk 后 3 个组间、各时间点间数据差异均不显著（P0.05）. 结论 CNTF 及 SCNA 一次玻璃体给药能在 1wk 内减缓视神经损伤后轴突数目的减少. Keywords:eye injury;optic nerve;ciliary neurotrophic fac-tor;Schwann cells neurotro
3、phic agent;rat Abstract:AIM To study the effects of ciliary neurotrophic factor（CNTF）and Schwann cell neurotrophic agent（SCNA）on changes of configuration and the number of nerve fibers in a rats model of the crushed optic nerve.METHODS The optic nerve injury model of rats was induced by crushed at t
4、he optic nerve1mm retrobulbarlly.Then an intravitreal injec-tion of CNTF（50ng）or SCNA（10L）was performed.The cross-section morphology changes were observed1，2，3and4weeks after injury，and the number of nerve fibers was de-termined by using a computerized image analysis system at the time points.RESULT
5、S The axon number of crushed op-tic nerve decreased but the matrix increased.The axon num-ber density of the CNTF group and the SCNA group was0.59and0.61of the normal level（0.10650.0056）one week after injury，while the control groups was0.55（P0.05）.But there was no difference in three groups2，3and4we
6、eks after injury.CONCLUSION An intravitreal injection of CNTF or SCNA can reduce the loss of optic nerve fibers in crushed optic nerve，so far only noted within one week after injury. 0 引言 19 世纪末至 20 世纪初，科学家们发现低等脊椎动物如鱼类和两栖类的中枢和外周神经系统（PNS）损伤后都能再生.然而在哺乳动物中，只有外周神经系统损伤后可以再生，而在中枢神经系统（CNS）则不能1 .直到 80 年代初 S
7、o 等2 发现体外中枢神经可以再生，体内神经细胞的轴突不能再生的原因可能为环境因素和抑制因素所致，从此该领域的研究取得一些突破性成果，特别是近十年来的研究工作使人确信，提供适当条件后 CNS 也是能够再生的.神经再生不仅是神经科学研究的一项重要课题，也是临床医学期待解决的问题之一.视神经损伤是临床上常见的眼外伤，往往引起视力丧失3 .由于视神经属于中枢神经系统，损伤后缺乏神经修复和再生所需的微环境和物质，因此视神经损伤后的治疗和功能恢复是临床上的一个难题4 .睫状神经营养因子（CNTF）能够促进多种神经细胞的存活，在神经系统发育、分化和损伤修复中具有非常重要的作用5，6 ;雪旺细胞是周围神经系
8、统的髓鞘形成细胞，它能分泌数种神经营养因子、细胞外基质、细胞粘附分子等，在周围神经系统成功再生过程中起关键作用6，7 .雪旺细胞源性神经营养活性物质（SCNA）是体外无血清培养乳鼠雪旺细胞 35d 时的培养液上清的超滤产物5，7 .我们采用大鼠视神经夹伤模型8 ，观察夹伤后视神经横断面的形态学变化和视神经轴突纤维数9，10 的变化规律，初步评估 CNTF 和 SCNA 对大鼠视神经损伤后修复的作用. 1 材料和方法 1.1 材料 二级成年 SD 大鼠，23mo 龄，雌雄不限，体质量200250g，由本校实验动物中心提供.自由饮食，在光/暗周期为12h/12h（光照时间 6:0018:00） 、
9、背景噪音（4010）db，温度（203）条件限制下饲养.研究者已获得实验动物使用许可证.实验动物及实验使用条件符合国家科学技术委员会的实验动物管理条例.将实验动物随机分为对照组、CNTF 组和 SCNA 组 3 组，各组又分为7，14，21 和 28d 等 4 组，每组 5 只动物.小号动脉阻血镊（上海医疗器械厂，前端 1mm 宽） ，CNTF（Sigma 公司，美国） ，体外无血清培养乳鼠的SCNA（西京医院眼科黄蔚博士馈赠）. 1.2 方法 视神经夹伤模型制作和玻璃体给药:大鼠 im846 麻醉剂（1mLkg-1 ）后置于手术盘中，消毒手术眼局部，于双目显微镜下切开外眦，打开 Tenon
10、囊，分离外直肌并剪断，沿颞侧巩膜表面钝性分离至视神经，于眼球后 23mm 处用小号动脉阻血镊夹压视神经 15s.治疗组用微量注射器先作前房穿刺，放出约 1015L 房水，然后自角巩膜缘后方 0.51mm 处穿刺入玻璃体，注入 CNTF50ng 或体外无血清培养乳鼠的 SCNA（西京医院眼科黄蔚博士馈赠）10L5，11 ，微量注射器注射头外径 0.05mm.将眼球复位，缝合 Tenon 囊及外眦，于直接检眼镜下观察视网膜血供良好者纳入试验.动物灌注固定及取材:分别在夹伤后 1，2，3 和 4wk 时，经 ip 戊巴比妥钠（100mgkg-1 ）深麻醉实验动物，开胸，经左心室插管至升主动脉做灌注固
11、定.先用 100mL 生理盐水冲净血液，再灌注 500mL 含 40gL-1 多聚甲醛（Sigma 公司，美国）的 0.1molL-1 磷酸缓冲液（PBS，pH7.3） ，持续1.52.0h.于动物头顶正中切开暴露脑组织并将其完整去除，显露视交叉及视神经，沿视神经走行分离至球后，紧贴眼球将 810mm 长短的视神经完整取下，去除视神经周围筋膜及脂肪组织，置于 40gL-1 多聚甲醛中后固定 24h，置于 30gL-1 戊二醛磷酸盐缓冲液中4冰箱保 存.标本超薄切片及甲苯胺蓝染色:保存的标本用 100mL 蔗糖缓冲液（0.18molL-1 ）冲洗，10gL-1 四氧化锇磷酸盐缓冲液再次后固定，梯
12、度丙酮溶液依次脱水，1kgL-1 丙酮/混合包埋剂（11）浸透，Epon812 包埋.在损伤区远端 2mm 处用 LKB-NOVO 型超薄切片机切取 1m 半薄横截切片，10gL-1 甲苯胺蓝染色，自来水冲洗，照相，保存.切片自然晾干，香柏油封片保存.计算机图像分析:A.神经横截面分析视场选取方法 在 100 倍镜下作视神经横截面的十字形分割线，然后在 200 倍镜下以纵向定位线中点为中心由上向下连续选取 3 个方形视场，每个视场面积为 12271.45m2 （图像分析仪固定数值）.B.神经轴突计数 使用北航病理图像分析系统进行视神经轴突计数10 .首先作图像分割，将神经纤维与间质分割开来，分
13、割好图像后定制将要选取的图像中神经纤维点平均积分光密度值（DPI）的最大值和最小值，最大值为 2000，最小值为 100.计算机自动图像分析系统自动校正放大率，所测数值均为实际值.C.神经纤维数密度的计算 将图像分析仪已数好的神经纤维数文件导入软件 Microsoft Excel（Microsoft 公司，美国） ，每组数据均选取 DPI 值在 0.201.50范围内的神经纤维点，以保证各样本的统一.此点数除以视场面积即为神经纤维密度，单位:个m-2 . 统计学处理:全部数据应用 Micro cal Origin5.0 软件包进行处理，对实验数据求均数及标准差，健眼作为正常对照.CNTF 组、
14、SCNA 组和对照组各组各时间点的数据之间分别进行配对 t 检验和单因素方差分析. 2 结果 2.1 视神经夹伤后形态学的变化 视神经夹伤后，从横断面上观察到神经纤维组织疏松，排列紊乱;神经髓鞘大量脱失，染色深浅不均;间质增多;1wk 时轴突广泛水肿;继续观察可见水肿消失，轴突纤维数大量减少，并出现许多空泡状结构（Fig1）. 2.2 视神经夹伤后神经纤维密度的变化 正常值为（0.10650.0056）个m-2 ，各组神经纤维密度在夹伤后13wk 内均有大幅度的下降（Tab1）. 3 讨论 视神经损伤后影响神经细胞变性、坏死和修复的因素较多，通过本实验，意在证明视神经损伤后能够减轻神经纤维坏死
15、的因素.临床视神经损伤分为非横断性损伤和横断损伤，非横断伤有一定的修复再生基础12 .本实验采用视神经夹伤模型，致伤部位选择在视神经球后段，致伤程度基本定量.视神经夹伤时间 15s，时间太短不足以创造可明确观察的损伤，时间太长容易将视神经夹断. 视神经纤维准确计数是观察视神经损伤、修复和再生的一个量化程度很高的方法5，13 .Sanchez 等9，10 通过视神经横断面神经髓鞘甲苯胺蓝染色，清楚地数清了猴和人视神经的神经纤维数.正常大鼠视神经纤维数约为 106 1.210714 .传统的石蜡切片和冰冻切片均太厚，视神经横断面上不能准确数清大鼠全部视神经纤维.本研究通过对大鼠视神经组织进行电镜方
16、法的固定、包埋、作横断面的 1m 超薄切片和视神经纤维髓鞘的特异染色，利用计算机自动图像分析系统，对正常大鼠视神经内一定大小直径的神经纤维数和夹伤后大鼠视神经内相应直径的神经纤维数的变化规律进行了观察和分析.在本视神经夹伤模型4，11 中观察到球后视神经夹伤引起的神经纤维减少主要发生在夹伤后 3wk 内，此期间视神经纤维数下降了 70%左右，4wk 视神经纤维数仅下降了 1.3%. 图 1 略 表 1 视神经夹伤后神经纤维密度的变化 略 为了使神经营养因子与其受体直接结合，需将 CNTF，SCNA 等神经营养物质注射到玻璃体内5 .虽然重复玻璃体内注射可能会增加 RGC 的存活，但同时也增加了
17、并发白内障和视网膜缺血的危险性.因此，在视神经损伤后我们采用了玻璃体内一次性注射神经营养物质的方法5 .CNTF 作为神经营养因子的一种，在神经活动中起着重要作用15 .CNTF 在进化上是高度保守的，不同种属之间有较大的同源性，人和大鼠、兔子的同源性达 85%以上6 .Mey 等5 在大鼠视神经横断模型实验中结合他人研究反复实验，得出体内应用的 CNTF 的有效剂量为 50ng.本实验在视神经夹伤后将 50ng（10L）重组人 CNTF 注入玻璃体内，观察到实验组神经纤维数的下降慢于对照组，在损伤早期尤为明显，说明重组人 CNTF 对于成年 SD 大鼠视神经损伤后轴突的坏死，神经纤维髓鞘的崩
18、解有一定的保护作用.雪旺细胞（SC）是周围神经系统的胶质细胞，SC 在周围神经系统再生过程中起关键作用2，5，7 .SC 能分泌神经营养因子，产生细胞外基质和细胞粘附分子等，这些物质都与神经再生有密切关系16 .本实验应用含多种神经营养因子的体外无血清培养的乳鼠雪旺细胞上清浓缩液，经检测具有较高的蛋白浓度（45gL-1 ） 11 ，在视神经夹伤后马上将 SCNA 注入大鼠夹伤眼玻璃体内，发现在夹伤后 1wk 内能够减缓视神经纤维的变性和坏死速度，与对照组相比差异显著. CNTF 和 SCNA 仅在早期起作用可能在于:视神经夹伤后仅在损伤当时玻璃体内一次给药，药物有效浓度及保留时间不明;损伤后的
19、修复与再生需要多个因子参与，单纯 CNTF 或 SCNA 不能够长期起作用;由于本实验是将重组人 CNTF 应用于大鼠，可能会因种属差异导致 CNTF 作用降低.CNTF 组和 SCNA 组间在各个时间点均无明显差异，表明在本组实验条件下两者对视神经损伤后的修复起着相似的作用. 参考文献: 1Han JS.Theneurosciencecompendium M.Beijing:Science and Technology Press，1993:2-3，35，117-121. 2So KF，Aguayo AJ.Lengthy regrowth of cut axons from gan-glio
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