1、康复训练对双侧海马梗死大鼠学习记忆功能的影响【关键词】 脑梗死/ Effect of rehabilitation training on function of learning and memory in rats with bilateral hippocampal infarction LI Ling, PAN HuiJuan. Department of Physiotherapy Rehabilitation, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033，China 【Abstract】 AIM:
2、 To investigate the changes of learning and memory function in hippocampus CA1 region in rats with bilateral hippocampal infarction after rehabilitation training. METHODS: Thirty rats were randomly divided into two groups after infarction induced by photochemistry: rehabilitation group and braking g
3、roup. The rats of rehabilitation group were given training three days after infarction while the rats of braking group were braked. The behavioral tests were performed at different times: before infarction, 3d after infarction, and 7d, 14d and 21d after training. RESULTS: The rats with infarction ha
4、d decreased learning and memory function compared with that before infarction. The rehabilitation group showed better score and faster recovery of learning and memory function than the braking group at different times after training. CONCLUSION: Rehabilitation training can accelerate the recovery of
5、 learning and memory function in rats with bilateral hippocampal infarction. 【Keywords】 Brain Infarction/rehabilitation; Hippocampus; learning;memory; rats 【摘要】 目的： 观察康复训练对海马梗死后学习记忆功能的影响.方法: 30只 SD大鼠采用光化学诱导法制作双侧海马梗死模型，于 24 h后将模型大鼠随机分为康复组和制动组，各 15只，于造模 3 d后开始分别给予康复训练或制动，分别在大鼠造模前、造模后 3 d、康复训练后7,14和 21
6、 d时进行学习记忆能力测试.结果： 大鼠双侧海马梗死后较梗死前学习记忆功能下降(P001)；康复组不同时相的学习记忆成绩较制动组恢复快（P005）.结论： 康复训练可促进双侧海马梗死大鼠学习记忆功能的恢复. 【关键词】 脑梗死/康复；海马；学习；记忆；大鼠 0 引言 学习记忆是大脑最基本也是最重要的高级神经功能之一，是中枢神经系统功能的整合.海马与学习记忆的关系密切，众多研究表明，损毁双侧海马动物的学习记忆能力明显下降，对大鼠的分辨学习、防御条件反应的保持及空间习得能力都有破坏1、2.脑缺血是危害人类健康的常见病、多发病，患者常有相应的运动、感知觉及学习记忆功能障碍，其中学习记忆障碍最为常见持
7、久，且严重影响患者的预后及生活质量.诸多研究表明，康复治疗对缺血性脑梗死患者在改善感觉、运动、行为能力方面已获得明显的疗效3,4.本实验即通过光化学法诱导的双侧海马梗死模型，观察大鼠双侧海马梗死后康复训练对学习记忆功能的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 自制冷光源由本科室和西安飞秒光电集团联合研制，光源为一充气氙灯，输出功率： Min 0008 W/cm2, Max 037 W/cm2，输出波长490550 nm，波峰 530 nm，输出端连一直径 06 mm的石英光纤. 1.1.2 实验动物及主要试剂 2级 SD大鼠 30只，体质量为（21010） g ，雄性，周龄 810
8、wk，由本校实验动物中心提供；四氯四碘荧光素钠（虎红，RB，北京化工厂，批号： 870627） ，密封避光保存，使用前用生理盐水稀释为 25 g/L的浓度. 1.2 器材 1.2.1Morris 水迷宫为一直径 150 cm、高 70 cm的圆池，内有乳白色溶液，水深 47 cm.池壁上标有东南西北 4个入水点，它们将水池分为4个象限.直径 8 cm、高 45 cm的白色站台，随机置于圆池内某一象限并固定，站台没于水面下 2 cm.训练期间周围参照物保持不变. 1.2.2 明暗箱一箱为明室，另一箱为暗室，均为 35 cm25 cm30 cm，两室有一拱形小门相通，室底均为铜栅,先将大鼠放置在箱
9、中适应 3 min，然后通电 5 min（ 50 V，交流电） ，并记录 5 min内的钻洞次数(即错误反应次数)，24 h后进行测试，记录潜伏期和 5 min内大鼠的钻洞次数. 1.3 方法 1.3.1 双侧海马梗死模型制作方法大鼠用 20 g/L戊巴比妥钠按 50 mg/kg常规麻醉后，将其俯卧于脑立体定位仪上，沿头颅正中切开头皮暴露颅骨，在前囟后 48 mm、中线向左旁开 36 mm处，用牙科钻轻轻钻一个直径约 1 mm的骨窗，光纤管尾端至皮层下 32 mm（海马 CA1区） ，再定位右侧与之对称的位置，并开一个骨窗.于尾 iv虎红（浓度为 70 mg/kg）后，立即通过光纤管照射一侧海
10、马组织，照射完毕时再补充原虎红剂量的一半，然后立即进行另一侧的冷光源照射.光照强度： Max，照射时间：各 30 min.术后缝合头皮，正常喂养. 1.3.2 水迷宫训练第 1日让大鼠自由游泳适应 2 min，从第 2日开始，从站台所占象限外的另 3个象限随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入池中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的潜伏期.如 2 min内找不到站台，则将其在站台上放置 30 s后再放回笼中，这时潜伏期记为 120 s.训练时分别从 3个不同的入水点入水，每次不同动物的入水点相同，训练顺序固定.此项主要训练大鼠的学习记忆功能和游泳能力. 1.3.3 动物分组将 30只大鼠于造模后随
11、机分为康复组和制动组，各15只.于造模 3 d后开始分别给予康复训练或制动，康复组每天上午训练3次，每次间隔 10 min；制动组进入制动笼（长 40 cm，直径 6 cm的网状笼）中饲养，在头端有一容器给予食物和水，四肢和身体处于固定状态. 1.3.4 学习记忆行为测试采用避暗法，该方法是测试被动回避反应；先将大鼠放置在箱中适应 3 min，然后通电 5 min（50 V，交流电） ，并记录 5 min内的钻洞次数(即错误反应次数)，24 h后进行测试.如大鼠进入暗室，因暗室底通有微弱的电流刺激大鼠,故大鼠逃出暗室，5 min以内不进入暗室,就完成了学习，24 h后的测试就是记忆能力；把大鼠
12、放入明室始至进入暗室的时间称作潜伏期,进入暗室的次数为错误次数.我们分别在大鼠造模前、造模后 3 d（训练前） 、康复训练后 7,14,21 d进行学习记忆能力测试. 统计学处理: 采用 SPSS120软件对明暗箱测试成绩进行统计，结果用 xs表达，对造模前及造模 3 d后的组内资料按配对设计进行配对 t检验；对造模后各时间点数据进行重复测量数据的方差分析. 2 结果 2.1 明暗箱测试潜伏期康复组和制动组造模 3 d后潜伏期明显较梗死前下降（t 值分别为 3364，4326；P 值分别为 0005，0001） ；从方差分析结果看，康复组与制动组之间的潜伏期存在明显差别(F=5158，P=00
13、31)，两组大鼠的记忆潜伏期均随时间逐渐恢复，但康复组较制动组恢复显著（Tab 1）.表 1康复、制动组不同时间的明暗箱测试潜伏期（略） 2.2 明暗箱测试错误次数康复组和制动组造模 3 d后明暗箱错误次数明显增多（t 值分别为-3873，-4000；P 值分别为 0002，0001） ；从方差分析结果看，康复组较制动组的错误次数明显减少（F=4699，P=0039） ，两组大鼠的学习成绩均随时间逐渐恢复，但康复组较制动组恢复显著（Tab 2）.表 2康复、制动组不同时间的明暗箱测试错误次数（略） 3 讨论 学习记忆是大脑最基本也是最重要的高级神经功能之一，是中枢神经系统功能的整合.海马与学习
14、记忆的关系密切，众多研究表明，损毁双侧海马动物的学习记忆能力明显下降，对大鼠的分辨学习、防御条件反应的保持及空间习得能力都有破坏1,2.而且研究表明海马与近期记忆有关，损伤海马可引起近期记忆的高度丧失，致使动物或患者丧失了学习新事物和新技巧的能力5.在大鼠实验中还观察到海马参与了近期记忆中的情节记忆过程，与空间位置的学习有关.海马损伤或切除海马，将造成顺行性遗忘症6. 在脑中风等脑缺血性疾病时，由于谷氨酸兴奋毒性作用，产生大量的自由基、兴奋性氨基酸，导致细胞内钙离子超载，造成神经细胞变性坏死7 ，影响了神经元之间的信息传递，并最终引致脑功能障碍.海马CA1区对缺氧缺血特别敏感8 ，刘汇波等9发
15、现大鼠双侧颈总动脉结扎后存活 30 d时动物的海马 CA1区神经元数目显著减少，大量神经细胞的轴突缺如,海马锥体细胞密度减低，模型大鼠还存在着与神经元损伤成正相关的学习记忆障碍. 诸多研究表明，康复治疗对缺血性脑梗死患者在改善感觉、运动、行为能力方面已获得明显的疗效3,4 ；记忆是中枢神经的整合,记忆细胞和分子基础定位于突触，记忆形成的基础是突触效应增强10.行为学习改变了树突和突触形态结构11 ，增加了运动皮层和海马突触数密度和面密度,活化海马和运动皮层的传入通路12 ；以及 NMDA受体密度的增多，加强了 NMDA受体依赖的 LTP的产生13.余茜等的研究亦发现，康复训练可使梗死大鼠海马突
16、触界面曲率和突触后致密物厚度增大以及穿孔性突触的百分率增多，使不同活性区传递功能大大增强，同时海马 NMDA受体通道开放电导水平、开放时间和开放概率的改变,进一步增强了突触传递功能，使其习得性 LTP形成速度明显快于对照组，其结果是影响整个脑的场电位300 而影响梗死大鼠的学习记忆行为14.本实验室既往的研究也证实康复训练能促进神经功能及学习记忆的恢复15. Morris 水迷宫是英国心理学家 Morris和其同事于 20世纪 80年代初设计并应用于学习记忆脑机制研究的16.此后,该迷宫系统被广泛运用在神经生物学领域的基础和应用研究中,实验动物主要是大鼠，是常用的检测空间学习记忆的装置.Mor
17、ris 水迷宫实验模型的优点是，能排除动物在完成作业而经过的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素对其他动物作业成绩产生的影响10.Chang 等17观察到长期的迷宫训练能促进神经元的树突发出侧支，何海蓉等18发现，适宜温度游泳能改善衰老动物学习记忆能力，可见水迷宫训练对神经信息回路的重建有积极意义.因此，在本实验中，我们采用 Morris水迷宫训练作为康复训练手段，观察了康复训练对双侧海马梗死后大鼠学习记忆功能的影响. 本实验结果表明,双侧海马梗死后,大鼠出现了明显的学习记忆能力下降,证实了海马对学习记忆功能的重要作用.海马局部血栓形成后组织缺血缺氧，产生大量的自由基、兴奋性氨基酸，导致细胞内钙
18、离子超载，造成神经细胞变性坏死，影响了神经元之间的信息传递，并最终导致学习记忆功能障碍.以上可能是海马梗死后导致学习记忆功能障碍的原因.从总体来看，康复组明显较制动组的明暗箱潜伏期延长、错误次数减少,说明康复训练促进了海马梗死大鼠的学习记忆功能的恢复.从时间上看，两组大鼠于训练后均出现潜伏期逐渐延长，错误次数逐渐减少，但康复组较制动组恢复明显.有研究发现损毁双侧海马导致的空间作业习得的损害，会随着训练次数的增加而逐渐减弱、消失.而且海马不同区域对学习和记忆的参与是不同的，如，损毁海马腹部大鼠分辨学习的保存明显受到破坏，而海马背部损毁其分辨学习的保存则不受影响；又如，应用电刺激和电毁损法发现，C
19、A1 区与分辨学习有关，齿状回则与分辨学习的反转有关，而 CA3区则在长时记忆的保持中起重要作用10.本实验模型为双侧海马 CA1区局灶性梗死，可能因为梗死灶仅局限于海马 CA1区，功能环路未完全破坏，或者大脑其他功能区参与了学习记忆的代偿，再加上大鼠本身功能恢复较快，导致制动组学习记忆成绩也逐渐恢复，但与康复组比较，其学习记忆成绩明显较差，仍能证实康复训练对学习记忆功能恢复的促进作用.康复训练可能通过改变梗死大鼠海马的突触结构，活化突触间传递通路，促进习得性 LTP的产生，进而增强海马突触效应的可塑性，改善大鼠认知功能，最终促进了海马梗死大鼠学习记忆功能的恢复. 总之，康复训练可以促进双侧海
20、马梗死大鼠学习记忆的恢复，至于其参与学习记忆的机制，以及如何促进海马与其他学习记忆相关脑区的功能整合，还有待进一步研究. 【参考文献】 1 Higashi H, Meno JR, Marwaha AS, et al. Hippocampal injury and neurobehavioral deficts following hyperglycemic cerebral ischemia: effect of theophylline and ZM 241385J. J Neurosurg, 2002; 96(1): 117-126. 2 Bachevalier J, Mishkin M.
21、 Mnemonic and neuropathological effects of occluding the posterior cerebral artery in Macaca mulattoJ. Neuropsychologia, 1989;27(1):83-105. 3 Ernst E. A review of stroke rehabilitation and physiotherapyJ. Stroke, 1990;21(7):1081-1085. 4 Friel KM，Nudo RJ. Recovery of motor function after focal cortic
22、al injury in primates: Compensatory movement patterns used during rehabilitation trainingJ. Somatosens Mot Res, 1998;15(3):173-189. 5 Hironaka N, Tanaka K, Izaki Y, et al. Memory-related acetylcholine efflux from rat prefrontal cortex and hippocampus: A microdialysis studyJ. Brain Res, 2001;901 (1-2
23、): 143-150. 6 余小平，王开发. 学习与记忆的机制简介J. 生物学通报, 1999; 34(5):21-22. Yu XP, Wang KF. Introduction of mechanism on learning and memoryJ. Bio Report, 1999;34(5):21-22. 7 万选才，杨天祝，徐承焘. 现代神经生物学M.北京： 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1999 :162. 8 Rod MR, Whishaw IQ, Auer RN. The relationship of structural ischemic brain damag
24、e to neurobehavioural deficit: The effect of postischemic MK-801J. Can J Psychol, 1990;44 (2) : 196-209. 9 刘汇波，叶翠飞，李斌，等. 双侧颈总动脉结扎对大鼠学习记忆功能和海马组织形态学的影响J. 基础医学与临床,1998;18(4):54-58. Liu HB, Ye CF, Li B, et al. Effects of ligaturing bilateral common carotid artery on learning and memory function as well
25、as histomorphology in hippocampus in ratsJ. Basic Med Sci Clin,1998;18(4):54-58. 10 韩太真,吴馥梅.学习记忆的神经生物学M.北京： 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998:61，170，230，287. 11 Ivanco TL, Racine RJ, Kolb B. Morphology of layer pyramidal neurons is altered following induction of LTP in sensorimotor cortex of the freely movin
26、g ratJ. Synapse ,2000;37(1): 16-22. 12 Rao BS, Raju TR, Meti BL. Increased numerical density of synapses in CA3 region of hippocampus and molecular layer of motor cortex after self-stimulation rewarding experienceJ. Neuroscience, 1999;91(3):799-803. 13 Stecher J, Muller WE, Hoyer S. Learning abilities depend on NMDA receptor density in hippocampus in adult
