1、抗人卵巢癌单链抗体噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定作者：杜辉，王建，辛晓燕，郑维国 【关键词】 卵巢肿瘤 【Abstract】 AIM: To construct the phage display library of antihuman ovarian cancer single chain Fv antibody. METHODS: The ScFv gene library was constructed by phage display technology. The affinity to antigen was detected by ELISA after pannin
2、g. RESULTS: Twentysix antigen binding clones were identified from 94 individual phagemid clones. CONCLUSION: In the production of engineering antibodies against human cancer, this strategy may provide an alternative approach. 【Keywords 】 phage display；single chain antibodies; ovarian neoplasms 【摘要】
3、目的： 构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库.方法： 利用噬菌体表面呈现技术，构建基因文库，经过 panning筛选富集后，用 ELISA方法检验抗原结合活性.结果： 从单个噬菌体克隆中筛选到 26个具有抗原结合活性的阳性克隆.结论： 噬菌体表面呈现技术为构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库提供了一条更为有效的新途径. 【关键词】 噬菌体表面呈现；单链抗体；卵巢肿瘤 0 引言 噬菌体表面呈现技术1是构建基因工程抗体的重大突破.利用噬菌体表面呈现技术构建的表达性基因文库称为噬菌体呈现文库2（Phage display library） ，该文库利用其呈现的多肽可与特定配基
4、亲和结合的性质而高效率地筛选目的基因，用于抗体基因文库和随机多肽基因文库的构建和筛选.单链抗体35 （SvFc）是用基因工程方法将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段连接肽（Linker）连接而成的重组蛋白，是保持了亲本抗体抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段.与完整 IgG几 Fab段相比，具有免疫原性低、血液清除快、肿瘤穿透力强等优点，因此是将药物、毒素、放射性毒素导向肿瘤的很有价值的分子，在肿瘤导向治疗和诊断试剂的发展上具有巨大的潜力.本实验就是利用噬菌体表面呈现技术，构建了抗人卵巢癌单连抗体基因噬菌体表面呈现文库，并从中筛选到了有抗原结合活性的抗体. 1 材料和方法
5、1.1 材料 1.1.1 实验动物 BALB/c小鼠，雌性，6 wk，体质量 1618 g，第四军医大学实验动物中心提供. 1.1.2 菌种及载体 E.coli TG1，pCANTAB5E，M13KO7 helper phage，购自 Pharmacia公司. 1.1.3 主要试剂福氏完全佐剂购自 Sigma公司；Trizal 试剂购自Gibco公司；反转录系统购自 Promega公司；PCR 引物和 HRP/羊抗 M13噬菌体抗体、T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自 Pharmacia公司；Taq DNA聚合酶购自 Takara公司. 1.1.4 试剂配置 SOBAG琼脂板蛋白胨 20 g
6、，酵母提取物 5 g，氯化钠 0.5 g，琼脂 15 g，加水至 900 mL，高压灭菌后冷却至 50-60，加入无菌的 1 molL-1氯化镁溶液 10 mL， 2 molL-1葡萄糖 55.6 mL，20 gL1氨苄青霉素 5 mL，立即铺板. 2YTAG2YT培养液中含 100 mg L1氨苄青霉素和 20 gL1葡萄糖. 2YTAK 2YT培养液中含 100 mgL1氨苄青霉素和 50 mgL1卡那霉素. 封闭液含 100 gL1牛奶的 1PBS. 1.2 方法 1.2.1 抗原制备取新鲜卵巢癌手术切除标本（取自西京医院妇产科，病理诊断为卵巢浆液性囊腺癌） ，按照高渗盐法6制备卵巢癌细
7、胞抗原，饱和硫酸铵沉淀后，0.01 molL-1 PBS透析，冷冻干燥，20保存备用. 1.2.2 动物致敏初次免疫，以抗原加福氏完全佐剂行皮下多点注射；第 2，3 次免疫，抗原腹腔注射；第 7周，ELISA 法检验抗体滴度，测滴度为 1106，进行第 4次免疫，以抗原加福氏完全佐剂行皮下多点注射；第 8周，抗原腹腔注射，连续免疫 3 d. 1.2.3 从总 RNA中纯化 mRNA及反转录取致敏小鼠脾脏，按每 100 mg组织加 Trizal 1 mL比例加入 Trizal，充分匀浆，提取总 RNA.参照Promega说明书纯化 mRNA.采用 Pharmacia公司的 Mouse ScFv
8、Module/Recombinant Phage Antibody System提供的反转录试剂合成CDNA第一链. 1.2.4VH，VL 基因的扩增和鉴定分别以 10种 VH和 VL混合物为引物，以 cDNA第一链为模板，PCR 扩增全套 VH,VL基因，反应体积 50 L，反应条件为： 94 1 min ，55 2 min ，72 2 min.共 30个循环.循环结束后，从各反应体系中取 5L 进行琼脂糖凝胶电泳.胶回收并纯化VH，VL 基因, 用 Pharmacia公司的 Mouse ScFv Module中提供的VHmarker定量. 1.2.5VH，VL 基因的拼接以纯化的 VH，V
9、L 基因为模板，以与 VH基因3端和 VL基因 5端序列互补的 linkerPrimer Mix为引物，进行重叠延伸反应，反应体积 50 L，反应条件为 941 min，63 4 min，共7个循环，将 VH，VL 随机拼接为 ScFv. 1.2.6ScFv 基因的扩增和鉴定在上述反应中，加入带有 Sfi酶切位点的 VH5端引物和带有 Not酶切位点的 VL3端引物，以上述 ScFv基因为模板，PCR 扩增，反应条件为：94 1 min , 55 2 min,72 2 min，共 30个循环，循环结束后，取 5 进行琼脂糖凝胶电泳.回收并纯化 ScFv基因扩增产物，用 Pharmacia公司的
10、 Mouse ScFv Module中提供的 ScFvMarker定量. 1.2.7ScFv 基因的克窿和鉴定纯化定量后 ScFv基因扩增产物，经Sfi，Not1 消化，与同种酶切开的 pCANTAB5E噬菌粒连接，取连接产物转化感受态 E.coli TG1，涂布于 SOBAG琼脂板上，30过夜培养，筛选出转化菌落，随机挑选 8个菌落，按小量碱裂解法提取噬菌粒 DNA，以Eco I，Hind 双酶切，琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，筛选出含ScFv基因片段的重组表达质粒，筛选得到的重组表达质粒再用 PCR进行鉴定. 1.2.8ScFv 基因噬菌体表面呈现文库的构建收集筛选出的全部转化菌落， 用 2
11、YAG稀释培养细菌悬液至 A600 nm=0.3，37,250 rmin1 震荡培养 1 h，加入 M13k07辅助噬菌体，37,250 rmin-1震荡培养 1 h，1000 g离心 10 min，并将细胞再悬浮于10 mL 2YTAK培养液中，37震荡培养过夜，1000 g离心 20 min，收集上清，即为抗人卵巢癌 ScFv噬菌体表面呈现文库. 1.2.9 重组噬菌体的 PEG沉淀在 10 mL重组噬菌体上清中加入 2 mL PEG/NaCl，混匀后，置冰上 3060 min, 1104g 离心 20 min，弃去全部上清，重悬沉淀于 16 mL 2YT培养液中. 1.2.10 噬菌体表
12、面呈现文库的 Panning筛选取提前配制好含 0.1 gL1叠氮钠的封闭液 14 mL稀释 PEG沉淀的 16 mL重组噬菌体，室温下孵育 10 15 min后，取 20 mL加入卵巢癌细胞抗原包被的锥形培养瓶中，37孵育 2 h.PBS，PBST 洗培养瓶，将 10 mL培养至对数生长期的 TG1细胞加入上述免疫吸附后的培养瓶内，37孵育 1 h，让吸附的重组噬菌体感染 TG1细胞，完成第一轮 Panning筛选.将 10 mL感染了重组噬菌体的 TG1细胞转移至 50 mL细菌培养管中，加氨苄青霉素至 100 mgL1、葡萄糖至终浓度 20 gL1，再加入 4 1010pfu M13K0
13、7，37，250 rmin1 震荡培养 1 h，同前述方法一样进行又一轮 Panning筛选.用相同方法完成第 3、第 4轮 Panning筛选，再感染 TG1细胞，得到富集的噬菌体克隆. 1.2.11抗原结合性的鉴定经 Panning筛选后，将再感染的 TG1细胞作不同浓度的稀释，涂布于 SOAGB琼脂板上，30培养过夜，随机挑选 94个单菌落，分别接种于 2YTAG培养液中，30,250 rmin-1培养过夜，次日按 110加入 含 51011 pfu L1 M13KO7辅助噬菌体的 2YTAG，37,150 rmin-1培养 2 h后离心，将沉淀用2YTAK培养液重悬，37，250 rm
14、in-1培养过夜，离心后的上清，即为单个克隆重组噬菌体.取待测上清加入封闭液，室温下孵育 10 min. 按常规方法进行 ELISA检测，94 个孔均用卵巢癌细胞抗原包被，封闭液包被阴性对照孔，Pharmacia 公司提供的阳性抗原包被阳性对照孔.封闭抗原板后，实验孔加待测上清与封闭液的混合物，对照孔加阳性对照噬菌体，二抗为 HRP/AntiM13多克隆抗体，用 H2O2ABTS显色，并测每孔的 A410 nm值. 2 结果 21VH， VL的扩增和鉴定扩增产物在 15 gL1琼脂糖凝胶中电泳，扩增出的 VH基因片段应为 340 bp，VL 基因片段为 325 bp，实验结果与预期结果相符（F
15、ig 1）. 22ScFv 基因的拼接、扩增和鉴定扩增产物在 15 gL1琼脂糖凝胶中电泳应得到一条约 750 bp的 ScFv片段，实验结果与预期结果相符（Fig 2）. VL：Amplification product of VL gene;VH：Amplification product of VH gene；M:DL2000. 图 1VH，VL 基因的扩增（略） Fig 1PCR amplification of VH，VL gene（略） M: DL2000. 图 2ScFv 基因的扩增（略） Fig 2ScFv products by PCR（略） 23ScFv 基因的克隆和文库的
16、构建随机挑选 8个转化菌落，小量法提取噬菌粒 DNA，以 EcoI, Hind 双酶切鉴定插入片段，含有重组噬菌粒者切出 2164 bp片段，不含插段者应切出 1414 bp, 8个克隆均切出约 2164 bp片段（Fig 3） ，将 EcoR I，Hind 双酶切筛选出的含有ScFv基因插段的重组表达质粒，进行 PCR鉴定，其中 7个克隆 PCR扩增出约 750bp的片段（Fig4） ，由上述两步鉴定可证明此 7个克隆均为正确插入 ScFv基因的重组表达载体 pCANTAB5E/ScFv，表明克隆成功. M：Hind；18：Recombinant ScFv phagemids. 图 3重组
17、SCFV噬菌粒的 EcoR和 Hin d 双酶切（略） Fig 3Digestion of recombinant ScFv phagemids with EcoRand Hind （略） M：DL2000；18： Recombinant ScFv phagemids. 图 4PCR鉴定 EcoR和 Hind 双酶切筛选得到的重组表达质粒（略）Fig 4Identification of positive recombinants by PCR（略） 24Panning 筛选及抗原结合活性鉴定加入 H2O2ABTS后，阳性克隆孔中液体变为绿色，阴性孔中液体不变色.显色后，阴性对照孔 A410
18、nm值为 0.01，阳性对照孔 A410 nm值为 1.41，共有 26个克隆呈现阳性反应（Fig 5） ，其 A410nm值分布于 0.591.15之间，阳性克隆检出率约为 27%.图 5单个克隆重组噬菌体抗原结合活性的 ELISA检测结果（略） Fig 5Results of the affinity to antigen of single clone recombinated phage detected by ELISA（略） 3 讨论 肿瘤抗原种类繁多，免疫原性低，难于纯化，其抗体制备非常困难.用常规方法制备的单抗往往种类单一，亲和力较低，且抗原性强，限制了其在临床上的应用，利用噬
19、菌体抗体库技术建立的抗肿瘤基因文库，可以绕过杂交瘤，甚至绕过免疫，很方便地得到针对多种肿瘤不同抗原，不同决定簇的功能抗体片段.经过几轮亲和结合洗涤洗脱繁殖的Panning过程，就可富集到含特异性抗体片段的噬菌体，从中筛选筛到目的克隆，其方法简便，快速，效率高. ScFv 是目前研制很多的具有完整抗原结合位点的最小抗体片段7,8.其分子结构简单，可在大肠杆菌中表达，易于基因操作和基因工程大量生产，可用基因工程的方法构建与其他效应分子连接的抗肿瘤融合蛋白，因此，在肿瘤显像和治疗中有潜在的优势9,10.本实验以人卵巢癌组织为抗原，采用噬菌体抗体库技术，从小鼠脾细胞中直接构建了抗人卵巢癌全套单链抗体基
20、因文库，一次从 94个克隆中筛选出 26个具有抗原结合性的抗体片段. 噬菌体呈现技术的发展对一些抗体基础上的新的药物试剂的研制具有重要作用.随着噬菌体呈现技术的发展，相应的各种抗体筛选方法也随之发展.目前人们不仅可以用纯化的抗原和已经知道其起源和表型的细胞对目标抗体进行筛选11,12 ，还可以在体内筛选到针对自然生理环境下未知分子的抗体13 ，这也使得噬菌体抗体库具有巨大的应用前景.抗体基因的多样性和可塑性提供了构建可能靶分子的新方法，单链抗体的多样性可从人自身噬菌体文库筛选的任何靶抗原上得到.从杂交瘤直接克隆的单链抗体还可进行抗体亲和成熟和特异性修饰的后续改造.用特异性抗原筛选的 ScFvs
21、的亲和性已证实有很宽的结合范围.DeNardo 等14将人自身噬菌体文库与 TAEA(Cu1,4,8,11,tetraazacyclo tetradecaneN,N，N,N te traaceticacid) 或 DOTA(Y1,4,7,10 tetraazacyc lo tetradecane N,N, N, Ntetraacetic acid)结合筛选得到的 ScFvs做 DNA酶解图谱分析已显示具有多样性，DNA 序列分析也证实 antiTAEA ScFvs表现出该 ScFvs家族的多样性.DeNardo 等 15 用同样方法从小鼠噬菌体文库中构建了 antiDOTA ScFvs和与淋巴
22、瘤相关的 HLA DR10 (Lym1) ScFvslymphomaassociated HLA DR10 (Lym1) ScFvs ，然后分别克隆出这两个抗体的轻重链，用一个 linker交叉将轻重链配对，得到了一个有生物学活性的双特异抗体. 目前，全套抗体库噬菌体表面呈现技术现已基本完善，可以预见由于噬菌体抗体库技术的应用，抗肿瘤抗体的制备将得到迅速的发展.本实验构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库的目的也在于希望利用噬菌体表面呈现技术在抗体筛选上的优势，得到针对卵巢癌的有生物学活性的特异抗体，为卵巢癌的导向治疗和诊断试剂的发展做出贡献. 【参考文献】 1Huse WD, Sa
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