1、利用恒溶氧补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组肿瘤导向多肽 LTLTNF作者：颜真 张英起 李波 赵宁 石继红 韩苇 王利兵 王增禄 【关键词】 重组 关键词: 重组，遗传;大肠杆菌;发酵;肿瘤坏死因子;肽类 摘 要:目的 探讨重组肿瘤导向多肽 LTL-TNF 工程菌的大规模培养与表达方法以获取重组 LTLTNF. 方法 首先在试管和三角瓶中探讨工程菌的生长和表达规律，筛选其最适宿主菌、最佳培养及诱导表达条件，然后在 5L 自控发酵罐中进行分批补料培养. 结果 保持培养过程中30%40%的溶解氧和限制性流加葡萄糖，工程菌 DH5/pBV-LTLTNF 在 5L发酵罐中培养至终密度 A600n
2、m 4050 时，目的蛋白的表达最高，可达菌体总蛋白的 50%，LTL-TNF 的含量达到 5.12gL-1 ，发酵总时间在 12h 左右. 结论 确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺，为重组肿瘤导向多肽 LTLTNF 工程菌的工业化生产奠定了基础. Keywords:recombination，genetic;Escherichia.coli;fermen-tation，tumor necrosis factor;peptides Abstract:AIM High cell density cultivation research on re-combinant E.coli to p
3、roduce recombinant tumor targeting peptide LTL-TNF.METHODS To determine its optimized host cell，culture and induction condition，this research first focused on understanding the growth and expression specifici-ty of recombinant LTLTNF on test tube and flask shaker.Then the fed-batch culture was carri
4、ed out on5L automatic fermentor.RESULTS By keeping dissolved oxygen at30%40%and limiting glucose feeding during fermentation，the recombinant protein LTLTNF production of DH5/pBV-LTLTNF in5L fermentor reached5.12gL-1 ，about50%of total amount of bacterial proteins，with the final cell densi-ty of A600n
5、m 4050in around12h.CONCLUSION A short cycle，high expression and stabilized fermentation process of recombinant LTLTNF has been established. 0 引言 针对肿瘤抗原和肿瘤血管的抗肿瘤治疗研究是目前肿瘤治疗研究的热点.人黑色素瘤蛋白多糖（human melanoma proteoglycan，HMP）及其大鼠的同源蛋白 NG2 分别于 1991 和 1996 年被鉴定和克隆1，2 ，HMP/NG2 主要表达于成年动物的肿瘤细胞和肿瘤血管细胞表面，而不表达于正常
6、组织，HMP/NG2 表达增高可促进黑色素瘤的增殖3 ，抗 NG2抗体在体内和体外均显示出抑制黑色素瘤细胞及肿瘤血管生长的特性3，4 ，故 HMP/NG2 已成为肿瘤治疗的靶向目标.LTL 十肽可特异性地结合 HMP/NG2 抗原，从而阻断 HMP/NG2 的作用5 .为了更好地发挥LTL 肽的抗肿瘤作用，我们构建了 LTL 肽与新型重组人肿瘤坏死因子（new type recombinant human tumor necrosis factor，nrhTNF）融合蛋白的重组表达载体，并在大肠杆菌中获得了该融合蛋白的表达，为了大量获取 LTLTNF，以配合动物实验和临床试验，我们对重组 LT
7、LTNF 工程菌的生长与表达规律进行了探索，建立了稳定的高密度发酵工艺. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 重组质粒与宿主菌 重组质粒 pBV-LTLT-NF 由第四军医大学生物技术中心构建和保存，含 LTL 十肽的核酸编码序列和编码突变型人肿瘤坏死因子 （nrhTNF）的基因序列6 ，受 PL PR 双重启动子控制，在 42时能诱导 LTLTNF 融合蛋白的表达，具有氨苄抗性. 宿主大肠杆菌 E.coli JM109recA1supE44en-dA1hsdR17gyrA94relA1thi（lac-proAB）F （t-raD36-prDAB+lacIq lacZM15） ，E.co
8、li DH5supE44lacU169（80lacZM15）hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1relA1由第四军医大学生物技术中心保存，E.coli YK537（supE44hsdR hsdM re-cA1phoA8leuB6thi lacy rpsL20galK2ara-14xyl-5mth-1）由中科院上海生物工程中心提供. 1.1.2 培养基 LB 培养基用于试管种子培养7 ，含葡萄糖的2YT 培养基用于摇瓶培养7 ，半合成培养基用于 5L 发酵罐中分批补料培养8 .补料基质含有（gL-1 ）:Trypton80，Yeast Extract40，Glycerol400
9、，MgSO4 7H2 O5. 1.1.3 仪器 Biostat C5L 自动发酵罐，德国 B.Braun 公司;J-6B 型大容量冷冻离心机，Bechman 公司产品;微量蛋白电泳仪，Bio-Rad 公司产品;Ultrascan XL 灰度扫描仪，LKB 产品. 1.2 方法 1.2.1 发酵用菌种筛选 pBV-LTLTNF 质粒 DNA 分别转化宿主大肠杆菌 JM109，DH5，YK537，30培养过夜，挑单菌落于 5mL LB 试管中，30200rmin-1 振摇培养至 A600nm 0.6 左右，42诱导表达. 1.2.2 摇瓶培养 将试管活化种子按 20mLL-1 接种于含150mL2
10、YT 的 500mL 摇瓶中，30，200rmin-1 振摇培养至对数中期，42诱导表达，或作为 5L 发酵罐的二级菌种. 1.2.3 5L 自控发酵罐中分批补料培养 将二级种子液按40mLL-1 接种至发酵罐.控制参数为:溶氧及转速控制溶氧30%，达到最大转速后，通入纯氧;温度诱导表达前控制为 30，诱导表达后控制为 42;pH 值设定为 7.0，自动流加 300mLL-1 氨水以保持恒定. 1.2.4 重组蛋白 LTLTNF 表达量测定 常规 SDS-PAGE 分析，灰度扫描仪分析重组蛋白占菌体总蛋白的百分含量. 2 结果 2.1 最适宿主菌筛选 将重组质粒 pBV-LTLTNF 分别转化
11、三种不同宿主菌 JM109，DH5 及 YK537，在三角瓶中模拟发酵罐中的补料培养，在诱导前加入 10mL 补料培养基，调 pH 至 7.0.结果，转化的 YK537 和DH5 的生长速度及表达重组蛋白的量相似，表达量均达到菌体总蛋白的50%，JM109 生长较慢，表达量约占菌体总蛋白的 40%（Fig1）. 图 1 略 2.2 三角瓶培养中诱导表达时间的优化 30三角瓶培养至对数中期（A600 =0.6） ，升温至 42诱导重组蛋白的表达，每 0.5h 取样一次，SDS-PAGE 分析表达情况.结果表明诱导 0.5h 后外源蛋白即开始表达，表达水平在 3h 内迅速提高，4.5h 达到高峰，
12、6h 后开始下降，菌体密度也有所降低.由此确定发酵结束时间可以在诱导后 45h，控制在菌体密度开始下降前. 2.3 三角瓶培养中起始诱导时机对 DH5/pBVLTLTNF 生长和重组蛋白表达的影响 在细菌生长的对数中期（培养 6h）升温诱导，可获得较高的重组蛋白表达，比早期和后期诱导均有明显提高（Tab1） ，这是因为在对数生长后期，营养的消耗和生长环境恶化可能导致外源基因表达能力的降低. 表 1 三角瓶培养中不同诱导时机对菌体终密度和 LTLTNF 表达量的影响 略 2.4 5L 发酵罐中 DH5/pBVLTLTNF 工程菌的高密度高表达培养 采用分批补料培养方式，在 Bio-stat C5
13、L 自控发酵罐中进行.在线控制pH7.0，溶解氧30%.补料流加分 3 个阶段:04h 不加，48h 设补料速度为 40mLh -1 左右，817h70mLh-1 左右.30生长，42诱导表达，诱导生长 4.5h 后收菌.Fig2 和 Fig3 分别显示发酵至 A600nm 50 时的在线控制图和 SDS-PAGE 电泳检测重组蛋白表达图.从图中可见 49h 是细菌生长的旺盛时期，此阶段细菌的比生长速率 在 0.2h-1 0.6h-1 之间，第 8h 开始升温，诱导 LTLTNF 的表达，2h 后细菌生长明显减慢， 降至0.13h-1 ，说明诱导后细菌的能量主要消耗在外源基因的表达上，特别是诱
14、导后第 2h，LTLTNF 蛋白占菌体总蛋白的含量从 18%陡升至 36%，4h后表达量达到 50%. 图 2 图 3 略 在发酵罐中 LTLTNF 重组菌的发酵随着培养密度增加，表达量呈锺罩形变化，当 A600nm 值超过 60 时，表达量有较明显降低.Tab2 显示不同生长密度下重组蛋白表达的结果. 3 讨论 重组 DNA 技术和大规模培养技术的有机结合，使得原来无法大量获得的天然蛋白和重组蛋白已可大量生产，并成功地应用于科研和制药工业等8-10 . 要提高重组蛋白的产率，不但要求重组大肠杆菌高水平地表达外源蛋白，而且要提高菌体密度，最终提高产物的比生产率. 表 2 5 升发酵罐中 DH5
15、/pBV-LTLTNF 发酵密度与蛋白表达的关系 略 这一目的的实现，除了合适的宿主菌、重组菌质粒的稳定性高、拷贝数多、理想的重组基因表达调控、产物的高表达水平外，还必须赋予重组菌生长和产物表达的最适环境条件，包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、pH，稳定的比生长速率、适宜的溶解氧以及营养物的合理流加等9，11 ，因此设计、控制工程菌的发酵过程中都必须考虑这些参数. 大肠杆菌的不同种和亚种对外源基因的表达产物会产生一定的影响，包括对表达产物的稳定性、代谢产物的积累等，并最终影响到细菌的生长密度12，13 .因此，在高密度发酵优化时应该考虑宿主菌的因素，选取最合适的表达宿主菌. 微生物的培养按
16、方式不同可分为:分批培养、分批补料培养、连续培养三种.传统的分批发酵技术所能得到的菌体密度很低，究其原因是培养过程中营养物质的过渡消耗和有害代谢产物的积累，导致菌体生长速率的降低.连续培养技术通过不断补充新鲜的培养基，同时以同样的速率将培养液从反应器中抽出，消除了有害代谢产物对生长的抑制作用，但是会造成培养基成分未充分利用和有用培养物的流失，且由于培养时间长易发生染菌和质粒的丢失.分批补料培养技术则是在培养过程中间断补充培养基，使菌体在较长时间内保持较高的生长速率，从而达到高密度.分批补料技术已广泛应用于重组大肠杆菌以及非重组大肠杆菌的高密度发酵，且每升发酵液菌体的密度已可超过 100g 干重
17、13-15 . 然而一般情况下，单位菌体的生产能力在高密度时往往低于低密度时8，10 ，这在我们以往对重组胸腺肽及重组新型人肿瘤坏死因子的发酵研究中便是如此7，9 .对重组 LTLTNF 工程菌的发酵研究，我们首先通过对试管和三角瓶培养条件的摸索，了解了该工程菌自身的生长和表达规律，然后控制发酵过程中溶解氧和碳源物质的浓度，用产酸量较少的甘油代替葡萄糖，并采用分阶段控制添加补料的步骤，降低有害废物（主要是乙酸）的积累，始终保持细菌较高的活性状态，成为DH5/pBV-LTLTNF 工程菌发酵成功的关键. 参考文献: 1Nishiyama A，Dahlin KJ，Prince JT，Johnsto
18、ne SR，Stallcup WB.The primary structure of NG2，a novel membrane-span-ning proteoglycan J.J Cell Biol，1991;114（2）:359-371. 2Pluschke G，Vanek M，Evans A，Dittmar T，Schmid P，Itin P，Filardo E，Reisfeld R.Molecular cloning of a human melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan J.Proc Natl Acad Sci
19、USA，1996;93（18）:9710-9715. 3Burg MA，Grako KA，Stallcup WB.Expression of the NG2proteoglycan enhances the growth and metastatic properties of melanoma cells J.J Cell Physiol，1998;177（2）:299-312. 4Harper JR，Reisfeld RA.Inhibition of anchorage independent growth of human melanoma cells by a monoclonal a
20、ntibody to a chondroitin sulfate proteoglycan J.J Natl Cancer Inst，1983;71（2）:259-263. 5Burg MA，Pasqualini R，Arap W，Ruoslahti E，Stallcup WB.NG2proteoglycan-binding peptides target tumor neovasculature J.Cancer Res，1999;59（12）:2869-2874. 6Yang H，Zhang YQ，Li FM，Wang JL，Wang ZL，Yan Z.Pu-rification of t
21、he new type human tumor necrosis factor expressedin E.coli J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv） ，1997;18（3）:221-224. 7Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning.A lab-oratory manual M2nd ed，New York Cold Spring Laboratory Press，1989:1-3. 8Yan Z，Zhang YQ，Li M，Chen CQ.High cell d
22、ensity fermenta-tion of recombinant human thymosin1J.Pharmaceutbiotech-nol，2000;7（4）:209-212. 9Lee SY.High cell-density culture of Escherichia coli J.Trends Biotechnol，1996;14（3）:198-205. 10Yan Z，Zhang YQ，Li M，Chen CQ.Fermentation research of new type recombinant human tumor necrosis factor alpha J.
23、Chin J Biochem Pharmaceut，2001;22（2）:11-13. 11Makrides SC.Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli J.Microbiol Review，1996;60（3）:512-538. 12Luli GW，Strohl WR.Comparison of growth，acetate produc-tion and acetate inhibition of Escherichia coli strains in batch and fed-batch fermentations J.Appl Environ Microbiol，1990;56（4）:1004-1011. 13Yee L，Blanch HW.Recombinant protein expression in high cell density fed-batch cultures of Escherichia coli J.Biotechnolo-gy，1992;10（12）:1550-1556.
