1、康复训练对大鼠脑梗死后 Fos 和 Hsp70 表达的影响作者：李玲，袁华，牟翔，徐莉 【关键词】 康复 关键词: 康复;脑梗死;基因，Fos;热休克蛋白质类 70 摘 要:目的 研究康复训练对脑梗死大鼠大脑皮质 Fos，Hsp70 表达的影响. 方法 采用 60只 SD大鼠制作脑梗死模型;1d 后随机分为康复组和制动组;康复组每天给予平衡、抓握、旋转、行走等训练，制动组置于网状笼内固定，各组在 1，7，14，21 和 28d检测 Fos，Hsp70 蛋白表达. 结果 康复组和制动组大鼠大脑皮质出现 Fos和 Hsp70阳性反应神经元，康复组反应明显较制动组强，对侧较梗死侧多. 结论 康复训练
2、可激活脑梗死大鼠大脑梗死灶周围和对侧相应皮质神经元功能，促进运动功能恢复. Keywords:rehabilitation;cerebral infarction;genes，Fos;heat shock proteins70 Abstract:AIM To study the effect of rehabilitation training on the expression of Fos and Hsp70in the cortex of cerebral infarcted rats.METHODS Sixty SD rats were given cere-bral infarcti
3、on and divided into2groups at random1d later:rehabilitation group was given balancing，grasping，rotating and walking exercises everyday，while immobilization group was fixed in cages.Immunohistochemistry was used to intect the Fos and Hsp70expression1，7，14，21and28d after in-farction respectively.RESUL
4、TS Fos-like immune reaction and Hsp70active neurons appeared in cortex of both sides. Rehabilitation group responded stronger than the immobiliza-tion group and the contralateral cortex stronger than that around the infarction area.CONCLUSION Rehabilitation training can activate the neurons around t
5、he infarction and in the contralateral cortex，and thus promote the recovery of ratsmotor functions. 0 引言 脑血管意外是一类死亡率、致残率很高的疾病，随着急救水平的提高，降低了死亡率，其后遗症的康复日益受到重视.康复训练对缺血性脑梗死患者在改善感觉、运动，行为能力方面可获得明显的疗效1 .以往的实验观察到康复训练对脑梗死大鼠运动、记忆功能恢复有促进作用2，3 ，但其机制尚不清楚.我们采用光化学诱导的大鼠脑梗死模型4 ，给予运动功能训练，在不同时期检测 Fos，Hsp70 在大鼠皮质中的表达，以
6、探讨功能康复可能的生物学基础. 1 材料和方法 1.1 材料 成年雄性 SD大鼠 60只，由本校实验动物中心提供，体质量（24050）g，12wk 大鼠随机分为康复组和制动组，各组再随机分为1，7，14，21 和 28d组（n=6）.康复组每天给予平衡、抓握力、旋转、行走等训练.制动组置于长 40cm，直径 6cm的网状笼内固定，在头端有一容器给予食物和水，四肢和身体处于固定状态.两组分别于造模后1，7，14，21 和 28d处死，进行免疫组织化学反应;实验材料:光源采用西安激光仪器厂生产的 B氦氖激光双管治疗机，输出波长 632.8nm（可见红光） ，输出功率 8mW，采用原光束双管照射.康
7、复评估与训练器材均采用自制设备4 :自制滚筒式网状训练器训练大鼠的抓握、旋转、行走等运动;平衡木用以评估及训练平衡功能;转棒训练评估及训练动态平衡功能;网屏训练评价前爪抓握能力及肌力情况. 1.2 方法 实验模型:用 10g L-1 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（3mL kg-1 ） ，股静脉注射 CPD4 （叶绿素光敏剂，杭州民生药厂生产） （40mg kg-1 ） ，10min后，将鼠俯卧位于脑定位仪上，沿头颅正中偏右切开头皮暴露颅骨前沿部位，在前囟后 1.8mm，正中线向右旁开约 2mm处用中央有一8mm5mm小孔的黑色避光纸遮避周围组织，He-Ne 激光（输出波长632.8nm，输出功率 8
8、mW，原光束双管）照射 20min，术后缝合头皮，避光 24h.康复训练组置于滚筒式网状训练器内转动训练行走及抓握功能，平衡木、转棒上进行静态及动态平衡训练，30min d-1 ，5 次 wk-1 ;大鼠在戊巴比妥钠深麻醉下，经主动脉灌注生理盐水 100mL，再灌注 40g L-1 多聚甲醛 400mL，取脑置于 300g L-1 蔗糖的 0.1mol L-1 PB中，4过夜，冰冻切片机连续切片，厚 30m，隔 5取 1收集于 0.01mol L-1 KPBS中.两套切片经漂洗 310min后入含 Triton X-100的KPBS30min（室温）;一套入兔抗鼠 Fos抗体（1 1000，S
9、anta Cruz） ，另一套入兔抗鼠 Hsp70抗体（1 3000，Sigma）各 4孵育 48h;再各经生物素化二抗（1 500，Sigma）室温孵育 2h，再入 ABC复合物（1 500，Sigma）室温孵育 2h，而后葡萄糖氧化酶 DAB硫酸镍铵加强法呈色，常规贴片、干燥、脱水透明、封片.每步间均用 0.01mol L-1 KPBS漂洗. 1.3 图象分析 每只大鼠大脑皮质切片在同一部位随机选取 5个视野，进行图像分析（瑞士 Leica公司 Quentiment570图像分析仪） ，计算 Fos样免疫阳性反应细胞的个数（cells） ，康复组与制动组间比较采用两样本 t检验，梗死侧与对
10、侧间比较采用配对 t检验. 2 结果 2.1 光镜观察 康复组梗死 1d，两侧大脑皮质即出现大量 Fos样免疫反应物质和Hsp70阳性神经元，从第 7日开始梗死灶周边出现大量星形胶质细胞，向外周逐渐延续为正常神经元，在梗死侧梗死灶周围皮质的 Fos和 Hsp70比对侧相应皮质少，随时间增加，阳性反应增强，梗死侧皮质 14d时反应最强（Fig1，2） ，随后开始降低，各时间段梗死侧阳性物质均少于对侧对应皮质.制动组梗死 1d Fos和 Hsp70阳性神经元反应与康复组基本一致，7d 时梗死灶周边胶质细胞很少，双侧皮质阳性反应增强，梗死侧梗死灶周围皮质阳性神经元数目比对侧相应皮质少，两侧皮质阳性神
11、经元数目均少于康复组. 2.2 图象分析 计数各时间段大鼠梗死侧和对侧皮质单位面积的 Fos免疫阳性物质的个数，再计算其平均数及标准差进行统计分析，2 组及各时间点均有明显差异（Tab1）.表 1 脑梗死大鼠皮质 Fos免疫阳性物质计数（略） 3 讨论 本实验所用的光化学诱导剂 CPD4 可以产生单态氧或氧自由基对内皮细胞造成直接损伤，随后凝血因子释放，血管收缩，血栓形成，血流停止，大脑发生缺血损伤5 .缺血可使 Glu含量剧增，通过 NMDA受体影响 c-fos基因表达.Fos 蛋白是即刻早期基因家族中一类 c-fos的蛋白产物，在很多种刺激下，通过不同的第二信使（Camp，Ca2+ ，甘油
12、二酯等）引起神经元 c-fos转录增多，形成 c-fos mRNA，再翻译成 Fos蛋白，与另一即刻早期基因 c-jun的表达产物 Jun蛋白形成二聚体，立即转入核内，调节靶基因的表达，引起一系列细胞反应，促使神经细胞对刺激、损伤产生不同的适应性变化，增强神经元的修复能力，加速神经元网络的重建，以恢复其正常功能.因此也被视为第三信使.由于它在一定程度上反映了神经元的功能活动，因此常被用于示踪神经功能通路6-8 .本实验中 Fos阳性神经元在梗死后出现，康复训练后大量增加，提示康复训练可使皮质神经元功能激活.康复训练组的 Fos表达有一个先升高后回落的过程，而制动组的 Fos表达随时间延长而降低
13、，提示康复训练和制动对大鼠脑皮质的影响明显不同，康复训练可以激活大量神经元，而制动则减少神经元活动，这可能是康复组大鼠功能较制动组明显恢复的原因之一. 热休克蛋白（heat shock protein70，Hsp70）是一类进化上高度保守的应激蛋白，在多种刺激作用下表达增加9 ，Hsp70 可促进某些变性蛋白的降解和清除，激活某些酶的活性，保护细胞功能，并增强对应激因子作用的抵抗力10，11 .本实验中梗死后 Hsp70出现表达是大鼠脑对不良刺激的应激反应，康复训练后 Hsp70的大量增加，可为梗死灶周围的皮质神经元提供保护作用，这可能是神经功能恢复的基础.对侧相应皮质也有阳性表达，对此我们考
14、虑一方面是康复训练过程中，尤其是早期未瘫痪侧肢体承担了大量的运动功能，从而激活了梗死对侧的皮质神经元，另一方面可能对侧相应皮质将通过两侧皮质间的联系而部分代偿梗死侧皮质的功能12 . 梗死后 1d梗死侧和对侧大脑皮质均出现了大量 Fos和 Hsp70阳性神经元，阳性神经元在皮质各层均有分布，这与 Dalton等13 报道一致.康复组 Fos和 Hsp70阳性神经元接受康复训练后继续升高，随着功能恢复逐渐下降，而制动组则没有先上升的特点而是逐渐下降，提示康复训练使大脑接受外周传入的信息和向外周传出的冲动增多，整个大脑皮质的功能都增强.康复训练一方面可以增加对梗死侧皮质的输 入刺激而维持和调节皮质
15、对外周的“最高中枢”的功能，另一方面可以通过刺激对侧相应皮质而促进其代偿功能.我们以往研究结果显示:康复训练组大鼠的前爪抓握力及肌力、平衡及协调能力的恢复快2 ，大脑功能的康复一方面是由于梗死灶周围水肿消失的自然康复，另一方面在此基础上的进一步康复得益于运动训练，Fos 和 Hsp70表达增加可能是康复训练对促进偏瘫鼠神经功能恢复的一个环节. 另外，在康复组观察到梗死灶周围非常明显的星型胶质细胞反应，12wk 尤其明显，而后逐渐减少.受伤的脑组织会产生一些因子（IL-1，IL-6，TNF，NGF 等）促进星形胶质细胞的过度生长和肥大14 .损伤部位因缺血导致代谢产物堆积和电解质紊乱，也可直接刺
16、激星形胶质细胞肥大增生的胶质细胞一方面充填空缺的空间，另一方面也会形成和分泌一些神经营养因子促进中枢神经轴索的生长和存活，从而起到一定的修复作用15，16 .在经康复训练后梗死灶周围的胶质细胞反应明显比对照组强，其提供的修复作用可能也是康复训练后大鼠运动功能恢复较快的原因之一.康复训练促进神经功能恢复的机理还在进一步研究之中. 参考文献: 1Yan TB，Dou ZL.Shiyong Tanhuan Kangfu（Practical rehabil-itation of paralysis） M .Beijing:Renmen Weisheng Chubanske（Peoples Medica
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