1、联合转染 Survivin 和 Bcl2 反义寡核苷酸对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用【摘要】 目的 探讨联合转染 Survivin 和 Bcl2 反义寡核苷酸（AsODN）对裸鼠胆囊癌生长抑制作用。方法建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型，选择 36 只裸鼠随机分为 3 组：对照组、正义寡核苷酸（sODN）组和 AsODN 组，裸鼠瘤体内分别注射 PBS、Survivin 和 Bcl2 sODN、Survivin 和 Bcl2 AsODN， 12 d 后处死裸鼠，测量瘤体体积及质量，计算抑瘤率；苏木精 伊红染色观察瘤体组织学变化；免疫组织化学方法检测 Survivin 及 Bcl2 蛋白的表达。结果 As
2、ODN 组裸鼠瘤体平均体积显著低于对照组、sODN 组（F=24.469，q=8.802、7.569，P0.01） ，其体积抑瘤率为55.53%，sODN 组为 9.90%；AsODN 组裸鼠瘤体平均质量显著低于对照组、sODN 组（F=25.376，q=3.168、20.737，P0.01） ，其质量抑瘤率为56.24%，sODN 组为 8.47%。AsODN 组瘤体中可见大量的凋亡细胞。免疫组化证实 AsODN 组 Survivin 表达明显降低，同 sODN 组相比差异有显著意义（F=15.103， q=5.883、7.191，P0.01） ；Bcl2 表达亦明显降低，同 sODN 组相
3、比差异有显著性（F=6.632，q=4.793、4.030，P0.05） 。结论 联合转染 Survivin 和Bcl2 AsODN 可下调 Survivin 和 Bcl2 表达，诱发细胞凋亡，从而抑制裸鼠胆囊癌种植瘤的生长。 【关键词】 胆囊肿瘤 寡核苷酸 反义 Survivin Bcl2 模型 动物 ABSTRACTObjectiveTo evaluate the inhibitory action of combining antisense oligonucleotide targeting Survivin and Bcl2 on growth of gallbladder carc
4、inoma in nude mouse.MethodsA model of human gallbladder carcinoma transplanted subcutaneously in nude mice was established. A total of 36 mice were divided into three groups: control group, Survivin and Bcl2 sODN group, as well as survivin and Bcl2 AsODN group. Twelve days later, the weight and volu
5、me of the tumor were measured and histology observed by HE staining, the expression of survivin and Bcl2 protein detected by immunohistochemistry SABC method.ResultsThe mean volume and weight of the tumors of AsODN group were significantly lower than that of the controls and sODN group (F=24.469,25.
6、376;q=3.168-20.737;P0.01). The inhibition rate of volume and weight of AsODN group was 55.53% and 56.24%, respectively, while that of sODN group was 9.90% and 8.47%. A lot of apoptotic cells were seen in tissue sections with HE staining, and the expression of survivin and Bcl2 protein was markedly l
7、ower than that of the control group and sODN group (F=15.103,6.632;q=4.030-7.191;P0.05). ConclusionCombining antisense oligonucleotide targeting survivin and Bcl2 could inhibit the growth of subcutaneous tumors in nude mice, the reason might be that they could downregulate the expression of survivin
8、 and Bcl2 and induce apoptosis of gallbladder carcinoma cell. KEY WORDSgallbladder neoplasms; oligonucleotides, antisense; Survivin; Bcl2; models, animal 反义核酸技术是近年兴起的一种生物技术，是肿瘤基因治疗的策略之一，其基本原理是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定互补的 DNA 或 RNA 片段（反义核酸）抑制或封闭专一靶基因表达的技术1，2 。Survivin 是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中一个结构独特的成员，特异性地表达于胚胎
9、发育组织以及多数人类肿瘤细胞，因为其表达的特异性，故可作为肿瘤治疗的新靶点。Bcl2 是最早发现的抑制细胞凋亡的蛋白，由 bcl2 编码，研究表明，bcl2 基因的易位和高表达与肿瘤的发生密切相关。国内外的研究表明，Bcl2 反义 RNA 可使一些肿瘤细胞 Bcl2 蛋白减少，细胞凋亡增加3 。本研究建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型，观察联合应用 Survivin 和 bcl2 的反义寡核苷酸（AsODN）对裸鼠胆囊癌的抑制效果，并初步探讨其机制。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 寡核苷酸（ODN） 针对 Survivin mRNA 的 AsODN 序列为5GGGGCACCCATGC
10、CGCCGCC3 ，正义寡核苷酸（sODN）序列为5GGCGGCGGCATGGGTGCCC3 ；针对 Bcl2 mRNA 的 AsODN 编码序列为 5CAGCGTGCGCCATCCTTCCC3 ，sODN 序列为5GGGAAGGATGGCGCACGCTG3 。AsODN 及 sODN 序列由上海生物工程公司采用 DNA 自动合成仪合成。 1.1.2 试剂 RPMI 1640 培养液及小牛血清购自杭州四季青公司。兔抗人 Survivin 多克隆抗体、兔抗人 Bcl2 多克隆抗体、SABC 及 DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司。 1.1.3 细胞株 胆囊癌细胞株 GBCSD 系山东大
11、学齐鲁医院普外科构建。 1.1.4 实验动物 BALB/cnu/nu 裸小鼠，46 周龄，雌雄兼用，体质量 1823 g，购自中国医学科学院实验动物研究所。 1.2 实验方法 1.2.1 裸小鼠胆囊癌模型的建立 取处于对数生长期 11010/L 的GBCSD 胆囊癌细胞，于每只裸鼠一侧背部皮下接种 0.2 mL 单细胞悬液，以皮下结节直径超过 0.5 cm 为成瘤标准。所有裸鼠于接种细胞后 2 周左右成瘤，成瘤率 100。 1.2.2 抑制种植瘤实验 取成瘤后裸鼠 36 只，称体质量后随机分为 3 组，每组 12 只。对照组每只裸鼠瘤体内多点注射 PBS 0.3 mL， sODN 组每只裸鼠瘤
12、体内多点注射 50 L 脂质体( Lipofectin)+Survivin sODN 及 Bcl2 sODN 各 100 g（0.3 mL） ，AsODN 组每只裸鼠瘤体内均行多点注射 50 L 的 LipofectinSurvivin AsODN 及 Bcl2 AsODN 各100 g（0.3 mL） ，每天注射 1 次。于注射后 12 d 断颈处死裸鼠，剥离肿瘤，分别测量肿瘤长轴（L） 、短轴（W） ，根据公式 V=1/2 LW2 计算肿瘤体积，称量瘤质量。然后将肿瘤组织储存于液氮中备用。肿瘤生长抑制率计算公式为：体积抑制率（1-治疗组平均体积/对照组平均体积）100，质量抑制率（1-治疗
13、组平均质量/对照组平均质量）100。 1.2.3 Survivin 及 Bcl2 蛋白表达的检测 采用免疫组织化学（SABC）法。 1.2.4 染色结果判定标准 细胞浆染成黄色或棕黄色为阳性染色。采用 Leica 全自动图像分析系统（德国） ，以阳性单位（PU）表示染色强度。随机选取 5 个高倍视野，选取灰度参数，计算 PU。PU|G-G|/Gmax100%。其中 G 为切片中所测内容的平均灰度，G 为切片中的背景灰度，Gmax 为最大灰度值。 1.2.5 细胞组织学观察 组织切片采用苏木精 伊红染色方法染色。1.3 统计学方法 采用 SPSS 11.5 for Windows 统计软件进行数
14、据处理，数据间比较采用单向方差分析（LSD 法） 。 2 结 果 2.1 联合转染 Survivin AsODN 和 Bcl2 AsODN 对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用 裸鼠成瘤后，经过 12 d 的治疗，AsODN 组裸鼠肿瘤体积明显小于对照组和 sODN 组，差异有显著性（F=24.469，q=8.802、7.569，P0.01） ，而对照组和 sODN 组之间的差异无显著意义（P0.05） 。AsODN 组裸鼠肿瘤质量明显小于对照组和sODN 组，差异有显著意义（F=25.376，q=3.168、20.737，P0.01） ，而对照组和 sODN 组之间差异无显著意义（P0.05） 。见表
15、 1。 2.2 Survivin 及 Bcl2 蛋白表达 对照组、sODN 组、AsODN 组胆囊癌组织中均有 Survivin 及 Bcl2蛋白的表达，主要位于细胞浆。AsODN 组 Survivin 的 染色强度明显低于对照组和 sODN 组，差异有显著性（F=15.103，q=5.883、7.191，P0.01） ，而对照组和 sODN 组之间差异无显著性（P0.05） 。AsODN 组 Bcl2 的 染色强度明显低于对照组和 sODN 组，差异有显著性（F=6.632，q=4.793、4.030，P0.05） ，而对照组和 sODN 组之间差异无显著性（P0.05） 。见表 2。表 1
16、 联合转染 Survivin 及 Bcl2 AsODN 对裸鼠皮下瘤生长的影响表 2 联合转染 Survivin 及 Bcl2 AsODN 后 Survivin 及 Bcl2 的表达(n=12,s)组 别 SuvivinBcl2 对照组 1.780.351.560.37sODN 组1.660.321.490.33AsODN 组 1.070.281.120.24 2.3 组织学观察 对照组及 sODN 组肿瘤细胞异型性明显，可见瘤巨细胞及多核瘤细胞，部分区域呈实性巢状排列，许多瘤细胞排列松散。AsODN 组肿瘤组织出现坏死区，可见淋巴细胞，并出现单个散在分布的，细胞核蓝染、碎裂、致密，胞浆淡红色
17、的凋亡细胞。 3 讨 论 胆囊癌是恶性程度较高的恶性肿瘤，术后 5 年生存率低于 5。目前常规的治疗方法仍以手术切除为主，辅助放射治疗和化疗，但效果不理想。基因治疗是近年来研究的热点，有望成为继手术、化疗和放疗后的另一种有前途的肿瘤治疗方法。目前，AsODN 已经成为治疗肿瘤等由于基因异常而引起的疾病的一类潜在性药物，为癌症的特异性治疗带来了希望。 细胞凋亡在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，而 IAP、Bcl2家族与凋亡密切相关。凋亡的调控主要通过 IAP 和 Bcl2 家族成员直接或间接抑制 Caspase 家族成员的活化来完成4 。Suvivin 基因是 IAP 家族的一个新成员,与效应
18、细胞蛋白酶受体1 位于人染色体 17q25 的同一基因组，与 G1 期调节蛋白相互作用，控制着各种 G2M 期调节细胞周期依赖基因表达5，6 。有研究显示，Survivin 蛋白在肝癌组织中的表达率为 48.8%，而在癌旁组织、肝硬化组织和正常肝组织中均未见表达7 。作为凋亡抑制蛋白，因为其仅在肿瘤组织中表达而在正常组织不表达或低表达8 ，使其靶向具有较好的特异性。GROSSMAN 等9转染针对Survivin 的 AsODN 到角质形成细胞株 HaCat 细胞，导致内源性 Survivin水平下降，细胞凋亡。MESRI 等10报道，针对 Survivin 的 AsODN 可抑制血管内皮生长因
19、子介导的内皮细胞保护作用，促进肿瘤血管形成过程中内皮细胞的凋亡和血管的退行改变。 bcl2 基因是 Bcl2 家族的重要一员，其编码的蛋白位于线粒体的外膜、核外膜和内质网外膜，主要通过抑制细胞色素 C 的释放来抑制细胞凋亡，增加肿瘤细胞数。因此，目前认为其异常表达与肿瘤的发生和发展有关。陆平等11报道，AsODN 作用于胃癌细胞后降低了 Bcl2蛋白及其 mRNA 的表达,并可见胃癌细胞出现凋亡特征性改变。 杀死和清除肿瘤细胞是治疗肿瘤的基本手段，由于细胞凋亡失衡是肿瘤形成及发展的重要原因，诱导肿瘤细胞凋亡无疑是治疗肿瘤的一条有效途径。与抑制或杀死肿瘤细胞的同时对健康组织带来损伤的治疗方法相比
20、，肿瘤细胞凋亡疗法可能会有效而无副作用。肿瘤的发生发展是多基因、多因素共同作用的结果，在不同的发展阶段，不同的癌基因或抑癌基因的数目、种类、作用方式各不相同，仅针对单一基因治疗的AsODN 不能起到完全抑制肿瘤细胞生长的目的。因此，我们分别设计了针对 Survivin 和 bcl2 基因的 AsODN（全硫代修饰） ，经人工合成后以阳离子脂质体为载体直接注射入裸鼠的胆囊癌瘤体组织中，结果显示，联合转染 Survivin 和 bcl2 基因的 AsODN 能够明显地抑制肿瘤的生长，AsODN 组裸鼠肿瘤体积和质量明显小于对照组和 sODN 组；sODN 组和对照组之间肿瘤体积、质量无明显差异；A
21、sODN 组肿瘤质量和体积抑制率分别为 56.24和 55.53，而 sODN 组仅为 8.47和 9.90，两组比较差异有显著性，表明联合转染针对 Survivin 和 bcl2 的 AsODN 对裸鼠皮下移植瘤的生长具有抑制作用。免疫组化观察结果显示，经联合转染后，Survivin 和 Bcl2 蛋白表达显著下降。组织学观察结果显示，AsODN 组肿瘤组织出现坏死区，可见淋巴细胞及单个散在分布的细胞核蓝染、碎裂、致密、胞浆淡红色的凋亡细胞。说明联合应用 Survivin 和 Bcl2 AsODN 可抑制 Survivin 和 Bcl2 mRNA 的表达，从而促进细胞凋亡。 因为不存在外源性
22、基因整合到宿主细胞 DNA 分子的过程，所以，应用 AsODN 抑制异常基因的表达，从而抑制肿瘤的生长，是一种比较安全的方法。AsODN 基因治疗与其他形式的基因治疗如利用逆转录病毒或质粒为载体的基因转染技术比较，安全性高，且简单易行，易于在临床推广。【参考文献】 1CROOKE S T. Progress in antisense technologyJ. Annu Rev Med, 2004,55:6195. 2CROOKE S T. Progress in antisense technology: the end of the beginningJ. Methods Enzymol,
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