1、盘状结构域受体 2 胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定作者：陈健康 张伟 刘楠楠 刘利兵 田菲 铁茹 【摘要】 目的： 盘状结构域受体 2（discoidin domain receptor2, DDR2）是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酪氨酸激酶，研究 DDR2 在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）软骨破坏和肿瘤转移中的作用. 方法： 在毕赤酵母中表达 DDR2 胞外区片段（不含信号肽和跨膜区，命名为 DR） ，并将所表达的蛋白进行纯化和功能鉴定，以备将来用作DDR2 的特异性阻断剂. 结果： 获得了两株较高表达 HisDR 融合蛋白的毕赤酵母克隆；其
2、表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的 18%；经 NiNTA(nitrictriacetic acid)柱纯化后，获得了纯度约 90%以上的可溶性 HisDR 融合蛋白；竞争结合抑制实验显示，HisDR 具有阻断和细胞表面天然 DDR2 受体结合的功能. 结论： 所表达的融合蛋白HisDR 具有抑制天然 DDR2 功能的作用. 【关键词】 盘状结构域受体 2：胞外区；基因表达；阻断剂 【Abstract】 AIM: To investigate the role of discoidin domain receptor 2 (DDR2) in the destruction of car
3、tilage in rheumatoid arthritis (RA) and tumor metastasis. METHODS: We expressed extracellular domain of DDR2 fused with a His tag to increase protein solubility and facilitate purification (without signal peptide and transmembrane domain, designated DR) in Pichia pastoris, purified the expressed pro
4、tein, and characterized its function, for the purpose of future application as a specific DDR2 antagonist. RESULTS: Two clones with relatively high expression of HisDR were obtained. After purification by a NiNTA (nitrictriacetic acid) chromatographic column, soluble fused HisDR with over 90% purity
5、 was obtained. Competitive binding inhibition assay demonstrated that the expressed HisDR could block the binding of DDR2 and natural DDR2 receptors on synovial cell surface. CONCLUSION: Extracellular domain of DDR2 fused with a His tag could block the binding of DDR2 and natural DDR2 receptors. 【Ke
6、ywords】 discoidin domain receptor 2; extracellular domain; gene expression; blocker 0 引言 盘状结构域受体(discoidin domain receptors，DDR2)是一类带有盘状结构域的受体型酪氨酸激酶，这类激酶在哺乳类动物体内有两种，分别为 DDRl 和 DDR21. 研究发现，这类激酶广泛分布，与某些肿瘤的转移相关，其中 DDRl 表达于肿瘤的组织细胞而 DDR2 表达于间质细胞2-6. 人关节滑膜组织也表达 DDR27. 对于 DDR2，纤维性胶原，如 I, 和型胶原，是它的配体，胶原与 DDR
7、2 的结合可上调细胞MMP1 的表达8. 为了研究 DR2 在肿瘤转移和类风湿性关节炎中的作用，DDR2 特异性阻断剂将是一个有力的工具. 但由于 DDR2 是一种比较新的分子，目前对它的研究又不多，所以尚无特异性的受体阻断剂. 可溶性受体作为特异性受体阻断剂已被广泛应用于多种受体的功能研究甚至作为抑制剂进入临床治疗. 其机理是在细胞外，外源的模拟受体分子由于与天然受体结构相同而竞争性地与相应配体结合，从而阻断了配体与天然受体的结合，也就抑制了配体和受体相应的功能. 我们采用此策略对 DDR2 胞外区用毕赤酵母系统进行了表达. 为了增加蛋白质的可溶性，选择了融合表达方式：采用 pPIC3.5K
8、 载体，表达His 融合蛋白. 融合蛋白经纯化后，通过竞争抑制实验验证其是否阻断配体 II 型胶原与细胞表面 DDR2 的结合，通过细胞实验验证其是否抑制II 型胶原刺激下的细胞 MMPl 的分泌. 1 材料和方法 1.1 材料 重组质粒 pRsetAddrg2 由本室构建；pPIC3.5K 酵母表达载体、酵母 GS115 菌种、氨基酸混合物、大肠杆菌 E.coli Top 10 F 购自 invitrogen 公司；酵母氮碱（YNB） 、酵母消解酶、酸洗玻璃珠、Tween20 为 Sigema 公司产品；山梨醇、胶回收和质粒提取试剂盒为上海华舜生物技术公司产品；鼠抗 6His mAb, NT
9、A 亲合介质购于 Qiagen 公司；HRP 标记的羊抗鼠二抗购自 Santa Cruz Biotechnology 公司；Western 发光底物为 Pierce 公司产品，NC 膜购于 Amersham 公司. 1.2 方法 1.2.1PCR 引物设计 pPIC3.5K 的多克隆位点只有 EcoRI 和 NotI 适合ddrg2 插入，考虑到 Kozak 序列（ACC ATG G）有利于外源基因在酵母中的表达，在 6 His 翻译起始码 ATG 上游引入 ACC，又将 ATG 后的 C 碱基突变为 G. 两条引物分别为：5端为：5 CGGAATTCACCATGGGGGGTTCTCATCAT
10、CATCAT 3和 3端为：5 CGGGCGGCCGCTTAAGTGTTGCTGTCATCAACTTTAAGCATTGG 3. 1.2.2PCR 产物回收、克隆及序列鉴定将 PCR 产物回收后直接与pMDl8T 载体连接，转化大肠杆菌后挑克隆酶切鉴定，将鉴定正确的克隆送基康公司测序. 1.2.3DR 片段在 pPIC3.5K 载体中的亚克隆大量提取重组 T 载体质粒，用 EcoRI 和 NotI 酶切出目的片段后，连入用同样方法处理的 pPIC3.5K载体，转化大肠杆菌后提取质粒，进行酶切鉴定. 1.2.4 重组载体的酵母电转化取 10 L（约 5 g）Sal单酶切线性化的 pPIC3.5Kd
11、dr2 重组质粒与 80 L 酵母电转化感受态细胞混匀，转移于预冷的 0.2 cm 电转化杯，冰浴 5 min. 电转化后（参数为 1500 V, 25 F, 200 ）立即加入 500 L 预冷的 1 mol/L 山梨醇，混匀，铺于 RDB 板，30培养 34 d. 以上过程同时做空载体对照. 1.2.5 多拷贝整合重组酵母的筛选用 2 mL 的 1 mol/L 山梨醇收集所有酵母重组菌落后混匀，分别取 100200 L 铺于含 G418 分别为 0, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3, 4, 5 mg/mL 的 YPD 板上，30培养 34 d. 1.2.6
12、 重组酵母菌落的 PCR 鉴定挑含 G418 浓度较高的 YPD 板上的单菌落于 0.5 mL 离心管中，加 10 L 去离子水、 5 L 5 U/L 的酵母消解酶混匀，30温育 10 min，再-70冻 10 min. 冰融后作为 PCR 模板，PCR 引物为 pPIC3.5K 载体多克隆位点两侧的引物：5端为：5GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3；3端为：5GCAAATGGCATTCTGACATCC3. PCR 反应参数为：94 30 s；56 1 min；72 90 s，30 个循环. 1.2.7DDR2DR 蛋白的酵母诱导表达及鉴定挑多拷贝重组酵母单菌落于 30 mL 的
13、MGY 培养液中，30, 250 r/min 培养 18 h. 室温 2500 r/min 离心 5 min，菌体重悬于 300 mL 的 MM 培养基中. 30培养 3 d（期间每隔 24 h 加甲醇至 5 g/L）后离心收菌，菌体沉淀用 10 mL 裂解液重悬后，加入等体积的酸洗玻璃珠剧烈振荡 30 s；冰浴 30 s，重复 8次. 4高速离心 10 min，上清为裂菌液. 取 15 L 裂菌液进行SDSPAGE 和 Western Blot 鉴定表达. 1.2.8DDR2DR 蛋白的亲合纯化用 10 mL 洗涤液平衡 NTANi2+ 柱，将裂菌液上样. 用 5 mL Lysis 缓冲液洗
14、柱，再用 15 mL Washing 缓冲液洗柱，用 3 mL Elution 缓冲液洗脱 DDRG2 蛋白，收集洗脱液，0.5 mL/管. 1.2.9 竞争结合抑制实验包被 RA 细胞于 96 孔板上，在 40 g/L 多聚甲醛中固定 24 h：PBS 洗涤 5 min 共 3 次. 加入倍比稀释的 HisDR 溶液. 空白对照为 His 纯化蛋白质洗脱液（内无蛋白质） ，阴性对照为 His纯化蛋白质(用 pRSETA 空载体转化大肠杆菌表达和纯化得到)，浓度为0.1 mg/L,各孔加入等量的 II 型胶原(不溶型，超声打散)的 PBS 液，37温育 1 h：PBS 洗涤 5 min 共 3
15、 次：加入抗型胶原抗体，37温育1 h： PBS 洗涤 5 min 共 3 次. 加入 HRP 标记的羊抗鼠二抗，37温育0.5 h. PBS 洗涤 5 min 共 3 次. 加入 ABTS 显色液显色 . 在 ELISA 仪上检测 A410 的吸光度. 2 结果 2.1DDR2 胞外区片段 DR 的 PCR 扩增、克隆和序列分析 10 g/L 琼脂糖电泳显示，PCR 产物为约 1.3 kb 的特异性片段，将此条带回收，即与pMDl8T 载体连接，酶切鉴定后，对其中一个阳性克隆进行测序，并将序列在 GenBank 中进行分析，结果显示，序列完全正确. 图 1 显示，PCR产物和重组 pMDl8
16、T 载体酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果. 2.2 重组酵母表达载体 pPIC3.5KDR 的构建及鉴定大量提取重组pMDl8T 载体质粒，用 EcoRI 和 NotI 酶切出目的片段后，连入用同样方法处理的 pPIC3.5K 载体，转化大肠杆菌后提取质粒，进行酶切鉴定. 图2 显示，重组 pPIC3.5KDR 载体的琼脂糖凝胶电泳结果. 2.3 重组酵母菌的筛选和 PCR 鉴定酵母电转化后每个 RBD 板上约长出5103 个 His 阳性单菌落，G418 浓度筛选最高为 4.0 mg/mL，根据同源重组一个载体约抵抗 0.25 mg/mL G418 估算，同源重组入同一酵母菌的pPIC3.5K
17、ddrg2 串联拷贝数最高可达到 15 个以上. 图 3 显示，重组酵母菌的 PCR 鉴定结果. 2.4DR 蛋白的表达和鉴定对 PCR 鉴定后的 3 号和 4 号重组菌进行目的蛋白质的诱导表达，SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，3, 4 号阳性克隆细菌在约 46 ku 处均有一新生表达条带（HisDR ） ，与目的蛋白质大小相符（图 4）. 根据薄层扫描结果分析，上清中的新生蛋白质约占融合蛋白质总量的 18. WesternBlot 验证结果显示：6 HisDDRG2 胞外区蛋白 DR 在毕赤酵母中可以表达，且为可溶性表达（图 5). 2.5HisDR 蛋白的纯化利用 NiNTA agaros
18、e 柱通过金属螯合亲合层析进行纯化，从酵母表达菌体的裂菌液上清中纯化出了天然可溶形式的 6 His 融合 DR 蛋白. 本实验中，洗脱液中含有目的蛋白质，薄层扫描分析显示，目的蛋白质纯度达 90.5（图 6）. 通过蛋白质定量，计算可溶性目的产物的得量约为 400 g/L 细菌(结果未列出). 2.6HisDR 对 II 型胶原与 DDR2 结合的竞争抑制功能我们摸索了在不同型胶原浓度(2.5 mg/L，0.25 mg/L， 0.025 mg/L)下，梯度浓度(0.4mg/L，110；1100；1200；1400；1800；11 600；13200；16 400；112 800；125 600
19、)的 HisDR 蛋白对胶原结合于细胞表面 DDR2 的影响. 这里 II 型胶原为不溶型的，反应时悬浮于 PBS 中. 结果显示(图 7)，对于胶原 0.025 mg/L 组，加入 His 纯化的其他蛋白做对照的孔显色最深，说明 His 纯化的其他蛋白无封闭 II 型胶原与细胞表面 DDR2 结合的功能；对于 HisDR 孔，从 0.4 mg/Ll800 范围内，基本无显色，说明 HisDR 可以完全封闭 II 型胶原与 DDR2 的结合；从 11600 开始有显色，13 200125 600 显色逐渐加深，说明 HisDR 的存在可以竞争抑制 II 型胶原与细胞表面 DDR2的结合. 表达
20、的 HisDR 融合蛋白在体外可以与 II 型胶原结合，起到竞争抑制 DDR2 受体的作用. 3 讨论 DDRs 是一类受体型蛋白酪氨酸激酶，由于其胞外区含有一个类似盘基网柄菌（discoidin）凝集素盘状结构 I 的 DR 结构，而被称为 DDRs. DDR2 广泛表达于多种组织，这种广泛又有选择性的分布提示，DDR2 的功能是重要且特异的1. 原位杂交显示，在肺癌和卵巢癌中，DDR2 在癌细胞周围间质细胞高表达，提示 DDR2 在肿瘤发展中具有作用，可能肿瘤细胞转化后的侵袭和转移特性由 DDR2 介导，因为恶性细胞突破组织屏障需要破坏胞外基质8. 其他能降解基质的人类疾病如肺纤维化、肝硬
21、化、骨硬化病和类风湿关节炎可能都存在 DDR2 的表达和信号转导过程，推测 DDR2 的一个重要功能可能是通过调节胶原的合成和降解来控制胶原性胞外基质水平. 若能找到阻断 DDR2 作用的分子，则可能有助于预防肿瘤细胞的转移和减轻类风湿性关节炎的软骨破坏9. 由于目前尚不清楚 DDR2 胞外区与配体胶原结合的具体部位，我们选择了 DDR2 胞外区全长含 399 个氨基酸的片段来表达，作为阻断剂. 在以往研究 DDR2 胞外区功能的时候，我们也曾构建了几种 GST 和 6 His 融合的 DDRG2 胞外区原核表达载体（4T1Ddrg2 和 pRsetADdrg2 ） ，但它们的表达形式无一例外
22、均是包涵体. 利用包涵体的变性和复性进行纯化，效果都不理想. 又考虑到变性和复性会影响 DDRG2 胞外区的结构与活性，于是我们便尝试在毕赤酵母中表达 DDRG2 胞外区蛋白. 毕赤酵母表达系统是比较新的酵母外源蛋白表达系统. 毕赤酵母表达质粒通过同源重组整合入酵母基因组而随同酵母染色体一起复制. 同源重组时，毕赤酵母表达质粒可以通过体内和体外两种方式多拷贝整合于毕赤酵母基因组中. 由于不同的基因具有不同的特性，在毕赤酵母中表达时，不同外源蛋白的表达水平可能会有很大的差异. 我们的实验表明，DDR2DR 在毕赤酵母表达系统中获得了表达，表达产物经过纯化后得到了纯度约为 90.5的融合蛋白. 竞
23、争结合实验表明，融合蛋白HisDR 在 0.2 g/L 的浓度下能完全阻断 II 型胶原与细胞表面天然DDR2 的结合. 虽然不能完全阻断，但仍可以说明两个问题：一是 NIH 3T3 细胞和 RA 滑膜细胞中的 DDR2 介导 MMP1 的表达或过表达；二是可溶性 DDR2 受体胞外区作为阻断剂，可以在一定程度下抑制这种表达. 【参考文献】 1Vogel W. Discoidin domain receptors: Structural relations and functional implicationsJ. FASEB J, 1999, 13(Suppl): S77-S82. 2Alv
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