1、BE血凝仪的工作原理、使用和保养,一、血凝仪的工作原理二、血凝仪的应用三、BE血凝仪的使用和保养,一、血凝仪的工作原理,目前开展的血栓/止血成份检测的主要方法有凝固法、底物显色法、免疫法、乳胶凝集法等。在血栓/止血检验中最常用的凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶时间（TT）、内源凝血因子、外源凝血因子、高分子量肝素、低分子量肝素、蛋白C、蛋白S等均可用凝固法测量。所以目前半自动血凝仪基本上都是以凝固法测量为主，而在全自动血凝仪中也一定有凝固法测量。 凝固法中又可分为光学法和磁珠法两类。由于光学法几乎可涵盖各种检测方法，为了降低仪器制造成本，全自
2、动血凝仪以光学法居多。但也有少数高级全自动血凝仪中凝固法测量采用无样品干扰的双磁路磁珠法，而其它测量采用光学法，并可同时进行检测。,1.血凝仪的检测原理,对第二代的传统的光学原理血凝仪容易受到标本的黄疸、脂血、乳糜血等的影响。对第三代的双磁路磁珠法原理的血凝仪在现今社会血黏度增高的趋势下也非常容易受到标本黏度变化的影响。第四代光电磁原理由此出现。,第一代，电流法：即是将待检样品作为电路的一部分，由于纤维蛋白具有导电性，可利用电流的断与否来判断纤维蛋白的形成与否，即判断凝固终点。具体表现为：将两电极插入待检样品，其中一个电极可以上下运动。当两个电极都在血浆中的时候，电路是连通的；当其中一个电极向
3、上运动离开血浆时，电路时断开的。往血浆中加入激活剂，血浆中纤维蛋白形成，此时可运动电极向上运动时，可勾起纤维蛋白丝。由于纤维蛋白丝是导电的，故此电路仍可连通，此时仪器即可将其判为凝固终点。,第二代，光学法：光学法血凝仪是根据血浆凝固过程中浊度的变化来测定凝血功能。根据仪器不同的光学测量原理，又可分为散射比浊法和透射比浊法两类。（1）散射比浊法：根据待检样品在凝固过程中散射光的变化来确定检测终点的。在该方法中检测通道的单色光源与光探测器呈90度直角，当向样品中加入凝血激活剂后，随样品中纤维蛋白凝块的形成过程，样品的散射光逐步增加，当样品完全凝固以后，散射光的强度不在变化，通常是把凝固的起始点作为
4、0%，凝固终点作为100%,把50%作为凝固时间。光探测器接收这一光学的变化，将其转化为电信号，经过放大再被传送到监测器上进行处理，描出凝固曲线。（2）透射比浊法：是根据待测样品在凝固过程中吸光度变化来确定凝固终点的，与散射比浊法不同的是该方法的光路同一般的比色法一样呈直线安排，来自光源的光线经过处理后变成平行光，透过待测样品后照射到光电管变成电信号，经过放大后监测处理。当向样品中加入凝血激活剂后，开始的吸光度非常弱，随着反应管中纤维蛋白凝血的形成，标本吸光度也逐渐增强，当凝块完全形成后，吸光度趋于恒定。血凝仪可以自动描绘吸光度的变化曲线并设定其中某一点对应的时间为凝固时间。,第三代，磁珠法：
5、磁珠法是根据血浆凝固过程中粘度的变化来测量凝血功能的。根据仪器对磁珠运动测量原理的不同，又可分为光电探测法和电磁珠探测法。（1）光电探测法：在磁珠法中光电探测器的作用与光学中的不同，它只测量血浆凝固过程中磁珠的运动规律，与血浆的浊度无关。在磁珠法中的一对电磁铁安放在测试杯的两端，它们产生恒定的交替磁场使磁珠在测试杯中摆动，在与磁珠摆动的垂直方向安放一对光电接收装置，在磁珠摆幅衰减到50%时确定凝固终点。（2）电磁探测法：电磁探测法又可称为双磁路磁珠法，其中一对磁路用于吸引磁珠摆动，另一对磁路利用磁珠摆动过程中对磁力线的切割所产生的电信号，对磁珠摆动幅度进行监控，当磁珠摆动幅度衰减到50%确定凝
6、固终点。,第四代，光电磁法：综上所述，前三代的检测原理都是终点法，即在检测前设置一个检测的终点，一旦达到检测停止的指标即判断凝血，这受到很多限制，无论是标本还是实验环境的改变都会引起检测的失准。第四代的光电磁原理结合了光学法和磁珠法之优点的第四代原理，测试杯中放有磁珠，测试时，测试杯下面的永久磁铁旋转，带动杯中磁珠沿杯壁旋转。测试杯的侧壁外安装有红外反射式光电器件监视磁珠运动变化。根据运动力学原理当血浆粘度增大后，旋转的磁珠将向杯中心靠拢，光电器件检测不到磁珠时检测结束。,光电磁原理是真正意义上的动态法检测，这样避免了：1、传统光学法对于标本颜色改变对于实验的影响，例如:黄疸、脂血、乳糜血；2
7、、传统磁珠法对于标本粘度改变对于实验的影响。现今随着社会发展，人体血液黏度逐渐升高，单纯的磁珠法已经并非往日的金标准。德国BE血凝仪就是应用的光电磁原理：以光学法为基础，磁珠起到了一个信号补偿作用，当血浆粘度增大后，旋转的磁珠向杯中心靠拢，当测试杯侧壁外安装的红外反射式光电器件检测不到磁珠运动变化时表明血浆凝固，即测量结束。,2.BE血凝仪的整个反应过程可以分为三个阶段：,一、不稳定期：也就是标本和实际进行了混匀之后并未完全进行反应的过程，这个阶段的变化比较大，两条绿线相差比较大，并逐渐的靠拢。反应曲线（紫线）在两条绿线之间行走。二、稳定期：标本和试剂完全的混匀之后开始进行了化学反应（整个反应
8、过程完全的处在模拟的人体生理环境下），两条绿线动态的开闭，但是趋近于一个平台，我们平时俗称为平台期，这期间未出现明显的凝血，而紫线也相对稳定的走形。三、凝血期：这时候紫线发生了迅速的变化，也就是出现了反应的质变，穿透平台期，出现凝血。这时候引入微积分概念，在整个紫线上每一点做切线，而切线斜率变化最大的一点也就是 A最大的一点即为凝血点。,二、血凝仪的应用,一、术前常规检查（出血危险过筛试验）：1.凝血酶原时间测定（PT）；2.活化部分凝血活酶时间测定（APTT）；3.凝血酶时间测定（TT）；4.纤维蛋白原含量测定（FIB）；5.血小板计数（PLT）；,二、术前凝血试验的重要意义：目的：确定患者
9、是否有止血功能缺陷（尤其是轻微止血异常）必要性：检出有出血倾向的患者，尤其是轻型，亚临床型凝血因子缺乏(先天或后天)。给予替代或对症治疗，防止术中、术后出血，术后伤口愈合差。结论：术前凝血检查具有非常重要的临床意义，是预防手术出血，保证手术安全，消除医疗隐患的必要步骤。,三、抗凝治疗的监测；四、口服抗凝剂治疗（OAT）的监测：PT实验是最常用的检测，用于监测由口服抗凝药物（香豆素/华法令之类）引起的维生素K依赖性因子II、VII和X功能性水平变化。血浆凝血酶原时间比率（PTR）1.5-2.0国际标准化比率（INR）2.0-3.0五、肝素治疗的监测：1.APTT：适用于肝素监测，但对不仅仅是肝素
10、引起的凝血异常同样敏感，如：肝素、OAT重叠治疗或溶栓治疗。2.肝素水平：特异的抗Xa因子试验，是具备国际标准化的特异性试验。3.血小板计数：用来判断任何肝素诱导的血小板减少症（HIT）4.ATIII：为防止肝素抵抗，需要检查有否抗凝血酶缺乏。,六、溶栓治疗的监测：1.纤维蛋白原(FIB)；2.凝血酶时间（TT）；3.纤维蛋白（原）降解产物（FDPs）。七、DIC的诊断：1.D-二聚体（D-Dimer）；2.纤维蛋白（原）降解产物（FDPs）；3.抗凝血酶III（AT-III）；4.凝血酶原时间（PT）；5.活化部分凝血活酶时间（APTT）；6.纤维蛋白原含量（FIB）。,三、BE血凝仪的使用
11、和保养,一、BE血凝仪的使用：1.开机并全灌注；2.准备好标本，仅需抗凝剂合适，并且标准离心就可以。3.试剂的准备：PT、APTT、TT、FIB试剂从冰箱取出后使用之前，均需在1525预温30min，用前轻轻混匀，不可剧烈摇动。3.开始实验：全离人化操作，包括中文报告全自动处理。,二、BE血凝仪的保养：1.机械保养：定期的润滑加样臂；2.液路保养：定期的完成特殊洗针的周保养程序（无须拆卸，仪器自带有此程序）；3.光路保养：使用清洁棒擦拭测量头的光学部分。,三、BE血凝仪的常见故障分析及其解决方法：1.出现“no communication”（无通讯）：a.检查COM口；b.检查电缆；c.检查T
12、hrombolyzer电源或没有开机；d.市电电压突然过低，应加装宽幅稳压电源。2.Cuvette出现卡杯子的现象：a.通过adjust中的motoer，测试个马达系统，以判断是否为马达问题。b.检查通道上是否有试剂或血浆所形成的薄膜，使杯子在传输过程中阻力太大，用潮湿的清洁棒来回清理通道（用Buffer）。c.是否为通道的出口处，杯子都叠起来很高，是杯子不能跌落而卡到折光板上的孔内。d.是否为杯子出口处的止挡销不能正常运动，可以查看Check magnet。e.是否在轨道上落下了钢珠，吧钢珠请走。,3.卤素灯太亮或太暗（Chrolamp too light/too dark)或四个通道间的重
13、复性不好：a.先用湿润的清洁棒（用Buffer沾湿）清洁检测位，然后进入adjust中选择motor，分别选择滤光片405/540nm，检查A/D转换值，并调节相应的电位器，使四个通道的A/D值为3150左右；b.是否为卤素灯的问题或是灯电压低；c.是否为光缆的问题；d.测量头扁平电缆老化，有虚接的地方，更换之。4.白色清洗槽出水不通畅，向上冒水：a.检查出水口滤膜是否有问题，更换或用10%的次氯酸钠浸泡，冲洗；b.“三通阀”螺丝是否拧紧；c.进水盒出水的泵是否漏气或不正常；d.液路是否有老化漏气或被压到了；e.废液桶是否太高或分页同的口太紧使废液管不能顺畅流通；f.清洗槽内是否有异物掉入。,
14、5.液面感应不灵敏：a.是否为加样针头上的电缆的问题；b.是否为Sensor的问题，进入adjust中选择test sensitivity of liquid sensor，用日历杯装300l导电液（生理盐水或Buffer），机器可检查到液体，如200l导电液机器无法检查到液体。如有不符，调节MBC板上电位器P5；c.检查加样针的牢固程度及传感器导线是否有问题。在主菜单下选择Adjust进入选sensors进入选择test stability of liquid sensors回车。显示Needle is dry用清洁板敲打针及传感器联线，如果显示Needle is dry有变化则敲打的部位有
15、问题。d.在母板上的LD1灯表示传感器的工作状态。若在不接传感器的情况下灯亮，则表明电源没有地线。e.是否为加样针受损。6.注射器连接加样针的端口流水或突然脱落：a.是否为连接管的连接处老化；b.是否为接口处的小型垫脱落、老化或是方向反了。,7.开机后显示异常报警（出现红屏、Lamp错误等）：a.可能是由于非法关机造成的；b.电脑的CPU算热有问题；c.电脑有病毒，丢失文件；d.在一号马达处杯子卡住，或者是在测量头处杯子卡住没有拍出来。8.加样针在加样时，上下不停的运动，而不进行采样，而且也不发出报警：a.试剂或是血浆的液面太高，倒出一点即可；b.调节加样针的“Z”轴位置，使其调高一点；c.传
16、感器与针上的部分可能出现短路或针的套管破损漏液。9.结果报告中频繁出现“EF65”或“EF66”：可以在“Install”菜单中的“Result Check”中调节参考范围值。,四、试验中可能会出现的问题：1.实验的重复性不好或不凝结：a.试剂的问题；b.对于FIB实验是否为Kaolin没有充分混匀或是到出的量过多、使用时间过长导致水分挥发、结晶析出；c.抗凝剂的问题。2.某一项或几项实验的检测值总是偏高或是偏低：a.是否是对应实验的试剂问题；b.是否为实验对应的试验参数有变化（若是建议重新安装试验参数盘）。3.实验结果不稳定：a.检查加样系统，是否为移液量不准确；b.加样针尖上总有一滴液体存
17、在，检查泵、阀及管路是否存在问题；c.全自动机器，试剂盘上装kaolin的杯子要用与磁搅拌子大小相吻合的，以防止沉淀，影响检测结果；d.提示lamp fail：灯路被堵住。,D-Dimer实验,一、D-Dimer的检测方法：测量D-dimer 的方法主要有以下几种：、手工或半自动操作方法，如乳胶凝集法和免疫渗滤法。这类方法只能提供定性或半定量结果，结果受人为因素影响而且无法进行大批量标本检测，因为操作繁琐成本高。、酶联免疫吸附试验（ELISA法）灵敏度高特异性强但耗费人力，操作时间长，不适宜做单个标本和急诊标本。 、全自动乳胶增强型免疫比浊法，这是目前最先进的检测方法，在血凝仪上操作完成。这种
18、方法的优点在于克服手工乳胶法和ELISA法的局限，不会受到人为因素的影响，既能快速进行单个标本检测又能方便地进行批量检测，无需特殊设备在进行常规血凝试验的同时就能完成D-dimer的准确定量测试。BE全自动血凝仪使用的就是乳胶增强型免疫比浊法。,二、D-Dimer的临床意义：、快速排除诊断：能在很短的时间内准确地作出深静脉栓塞（ DVT ）、肺栓塞（ PE ）、弥散性血管内凝血（ DIC ）的排除诊断，减少病人身体和经济上的损失。、DIC 的监控： DIC 是一种严重的获得性出血综合征包含了复杂的病理生理过程，死亡率极高。配合实验室检查进行早期诊断，及时诊断是其治疗成功的关键。 D-dimer
19、 是反应病态过程的核心指标，直接影响治疗方案。但手工或半自动方法只能提供定性或半定量结果，根本无法判断变化的程度和过程，常延误病情，造成无法挽救的严重后果。快速的定量方法既能准确及时作出诊断又能监测整个病态发展过程，及时给予治疗。、有效的溶栓治疗监测： D-dimer 是交联纤维蛋白的降解产物，它的升高是血栓溶解的直接证据，是反映溶栓治疗是否有效的关键指标。通过定量检测可以反映 D-dimer 的变化，提示医生用药是否见效，当 D-dimer 的量在治疗过程中不断上升然后出现下降则提示医生可逐渐停药，这样既不会导致用药不足血栓复发，也不会因用药过量导致出血的危险。、区分生理性和病理性纤溶。根据
20、 D-dimer 的量和连续监测，可以准确区分生理性偏高或病理性偏高，前者量不会很高而且不会持续性升高。但如用定性或半定量的方法就较难区分容易误导临床。,三、D-Dimer定标方法：1.将试剂从冰箱中拿出后静置于室温待试剂稳定；2.用试剂盒里面的Saline复溶试剂盒内的定值血浆，在室温静置15min左右。3.在Set-up里将参数按照说明书要求设定，在光标停留在Calibration上的时候按回车键，在Test里以上下键选择到需要定标的D-Dimer项目，并按回车键确认，其中，Automatic为半自动定标，即将定值血浆按比例稀释放入指定位子；Fully Aut为全自动定标，即将定值血浆和B
21、uffer放入指定位子，让仪器自动稀释并完成定标；Manual为手动定标，即将稀释各个点的血浆当标本放在样品盘上测量，然后将测量的数值手动输入到电脑里即可。（注意：定标前要灌注一到二次，提高定标的成功率。）4.选择全自动定标后，将光标停留在第一个稀释比率的位置，可以用空格键进行更改，推荐稀释比率为1：1、1：2、1：4、1：8、1：16（五点法），将高值血浆放在试剂盘Control 1位子，在样品盘上的X1、X2、X3、X4和29号位放入空的日立杯，点击Start开始定标；选择半自动定标则输入已知的浓度，然后在在样品盘上的X1、X2、X3、X4和29号位放入稀释好了的标浆，点击Start开始定标。,
