1、趋化因子受体 CCR7 促进乳腺癌细胞的趋化与侵袭作者：马飞，宁力，张颖妹，徐兵河 【关键词】 乳腺肿瘤 【Abstract】 AIM: To study the chemotaxis and invasion of breast cancer cells facilitated by CC chemokine receptor7 (CCR7). METHODS: Reverse transcriptionPCR analysis of CCR7 was performed in three breast cancer cell lines. The chemotaxis and invasi
2、on assays were performed on breast cancer cells in presence of secondary lymphoid tissue chemokine (SLC), a ligand of CCR7, and when CCR7 was blocked. RESULTS: Breast cancer cell lines expressed different levels of CCR7 mRNA. SLCmediated chemotaxis and invasion could be checked in those breast cance
3、r cells. Both chemotaxis and invasion could be blocked by neutralizing antiCCR7 antibody. CONCLUSION: Chemotaxis and invasion of breast cancer cells can be facilitated by CCR7 expression. CCR7 may play an important role in the lymph node metastasis of breast cancer. 【Keywords】 chemokine S CC; recept
4、ors, chemokine; CCR7; breast neoplasms; lymphatic metastasis 【摘要】 目的： 研究趋化因子受体 CCR7的表达对乳腺癌细胞趋化活性与侵袭活性的促进作用. 方法： RTPCR法测定 3株乳腺癌细胞MCF7, MDAMB231, MDAMB361中 CCR7的表达；在 CCR7的配体 SLC作用下，通过趋化小室法检测不同乳腺癌细胞的趋化活性与侵袭活性；检测 CCR7的封闭对乳腺癌细胞趋化活性和侵袭活性的影响. 结果： 3株乳腺癌细胞中均存在不同程度 CCR7的表达，其配体 SLC对 3种乳腺癌细胞均存在不同程度的趋化活性和侵袭活性，CC
5、R7 的封闭也能够在不同程度上抑制乳腺癌细胞的这种趋化活性和侵袭活性. 结论： 趋化因子受体 CCR7的表达能够促进乳腺癌细胞的趋化与侵袭，从而可能在乳腺癌细胞向淋巴结转移中发挥重要作用. 【关键词】 趋化细胞因子类，CC；受体，趋化因子；CCR7；乳腺肿瘤；淋巴转移 0 引言 许多恶性肿瘤细胞都能够特异性表达特定的趋化因子受体，如 CXCR4, CCR7, CCR10等，目前认为它们的表达在恶性肿瘤器官特异性转移中发挥重要作用1. 其中 CC家族趋化因子受体 CCR7的配体 SLC（secondary lymphoid tissue chemokine）和 ELC（EBI1ligand ch
6、emokine）在淋巴结中特异性高表达，而许多肿瘤细胞表面有 CCR7的表达. 研究证实，CCR7的表达与多种恶性肿瘤的淋巴结转移密切相关，其中包括食管癌2 、胃癌3 、肺癌4等，然而 CCR7是否也参与了乳腺癌淋巴结转移的形成，尚无定论1. 为此，我们体外检测了不同乳腺癌细胞株CCR7的表达，并且评价了 CCR7的表达对体外 SLC介导的乳腺癌细胞的趋化与侵袭的影响，为进一步研究乳腺癌细胞向淋巴结转移的机制奠定了基础. 1 材料和方法 11 材料 乳腺癌细胞株 MCF7, MDAMB231, MDAMB361由本室常规传代培养；Trizol RNA提取试剂盒，购自 Life Technolo
7、gies公司；MMLV 逆转录酶，DTT, DEPC等购自 Gibco公司；OligodT15 购自 Promega公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs 购自 TakaRa公司；人趋化因子 SLC由医科院肿瘤研究所张叔人教授惠赠；人 CCR7 mAb购自 RD Systems公司；趋化小室与多聚碳酸酯膜（8.0 m 孔径，25 mm80 mm） ，购自 Neutroprobe公司. 12 方法 1.2.1 乳腺癌细胞 CCR7表达的检测各取 1106的不同乳腺癌细胞，按照 Trizol RNA提取试剂盒说明提取细胞总 RNA. 取 6 g 总 RNA与0.5 g oligodT15混合，逆转
8、录获得 cDNA. 以其作为模板，PCR 扩增CCR7中一大小为 530 bp的片段. 所用的上游引物为5TCCTTCTCATCAGCAAGCTGT 3，下游引物为5GAGGCAGCCCAGGTCCTTGAAG 3. 具体反应步骤为： 37 1 h， 72 5 min，完成逆转录；94 变性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸30 s，35 个循环完成 PCR后，再 72 充分延伸 10 min. 以人 Tubulin作为内对照，其上游引物为 5CTCATCACAGGCAAGGAAGAT3，下游引物为 5TTAAGGTAAGTGTAGGTTGGG3，大小为 410 bp. 扩增产物进行
9、 1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳，以各自 Tubulin作为内对照调整上样量，电泳图像经 Fluors MultiImager凝胶成像扫描仪分析，比较乳腺癌细胞中 CCR7的相对表达量. 1.2.2 乳腺癌细胞趋化活性的检测采用 Boyden趋化小室法5体外行趋化活性分析，趋化实验具体步骤如下： 在趋化小室的底孔中，加入27 L 含 100 nmol/L SLC的无血清 RPMI1640培养液，同时以无血清RPMI1640培养液作为阴性对照加入底孔中；上面覆盖 8.0 m 孔径的多聚碳酸酯膜，再覆盖上顶板. 在趋化小室顶孔中加入 50 L 乳腺癌细胞（1109/L 重悬于无血清 RPMI1640
10、培养液中） ；将整个小室置 37 , 50 mL/L CO2孵育箱中作用 8 h. 取出多聚碳酸酯膜，刮去上表面残留的乳腺癌细胞，将整个膜置于 40 g/L甲醛中固定，再行姬姆萨染液染色；每组行 3个复孔平行检测，每个小孔随机计数 5个高倍视野下迁移至多聚碳酸酯膜背面乳腺癌细胞的总数，并计算趋化指数（chemotactic index, CI） ，CI=检测组平均迁移细胞总数/阴性对照组平均迁移细胞总数. 1.2.3 乳腺癌细胞侵袭活性的检测仍然采用 Boyden趋化小室法体外检测乳腺癌细胞的侵袭活性，方法大致同趋化实验，改动包括： 在趋化小室顶孔的多聚碳酸酯膜上预先铺入 Matrigel 基
11、质胶（每孔约 50 g） ，并且趋化小室在孵育箱中作用时间延长至 20 h，每组同样行 3个复孔平行检测，每孔随机计数 5个高倍视野下迁移至多聚碳酸酯膜背面的乳腺癌细胞总数. 以侵袭指数（invasion index, II）表示侵袭活性，II=检测组穿过基质胶平均细胞总数/阴性对照组穿过基质胶平均细胞总数. 1.2.4CCR7 的封闭对乳腺癌细胞趋化活性和侵袭活性的影响 Boyden趋化小室法检测趋化活性和侵袭活性的具体方法同上，底孔中各加入 27 L 含 100 nmol/L SLC的无血清 RPMI1640培养液，顶孔中各加入 50 L 的 1109/L乳腺癌细胞的无血清 RPMI164
12、0培养液，再加入 5 mg/L的 CCR7 mAb进行受体封闭（此为处理组，同时以不加 CCR7 mAb的孔为对照组） ，每组均行 5个复孔的平行检测，分别行趋化活性和侵袭活性检测，并分别计算抑制率. 抑制率=（对照组平均迁移细胞总数-处理组平均迁移细胞总数）/ 对照组平均迁移细胞总数100%. 统计学处理： 数据以 xs表示，组间方差齐时采用 t检验，方差不齐时采用非参数 MannWhitney检验，统计学处理均采用 SPSS 10.0统计软件包进行. 2 结果 2.1 乳腺癌细胞 CCR7的表达乳腺癌细胞系 MCF7, MDAMB231, MDAMB361中，通过 RTPCR法均能扩增出人
13、 Tubulin基因片段和 CCR7中选定的基因片段，以 Tubulin为参照，比较各株乳腺癌细胞 CCR7的相对含量. 结果发现，3 株乳腺癌细胞均有不同程度 CCR7的 mRNA表达，其中以MDAMB361表达量最高，MDAMB231 次之，MCF7 表达量最低，三者 CCR7 相对含量分别为 2.54, 0.43, 0.29（Fig 1）. 2.2 乳腺癌细胞的趋化活性趋化小室法催化实验发现： 在 100 nmol/L的 SLC作用下，迁移至多聚碳酸酯膜背面的 3种乳腺癌细胞数，均明显多于各自相应的阴性对照组迁移细胞数（Tab 1）. 说明 CCR7的配体 SLC对 3种乳腺癌细胞均有不
14、同程度的趋化活性（Fig 2）.表 1100 nmol/L SLC作用下乳腺癌细胞的趋化活性（略） 2.3 乳腺癌细胞的侵袭活性同样选择 100 nmol/L浓度的 SLC置于趋化小室底孔，行侵袭实验检测不同乳腺癌细胞的侵袭活性. 结果发现：在 SLC作用下，3 种乳腺癌细胞均能够穿透 Matrigel 基质胶到达多聚碳酸酯膜的背面，膜背面细胞数均明显多于相应的阴性对照组，说明在SLC作用下 3种细胞均表现出不同程度的侵袭活性（Tab 2）.表 2乳腺癌细胞的侵袭活性（略） 2.4CCR7 的封闭对趋化活性和侵袭活性的抑制将乳腺癌细胞经 CCR7单克隆抗体孵育后，分别检测 CCR7受体的封闭对
15、 SLC介导的乳腺癌细胞的趋化活性和侵袭活性的影响. 结果发现，CCR7 受体的封闭均能不同程度上抑制 3种乳腺癌细胞 SLC介导的趋化活性和侵袭活性（Tab 3,4）. 结果说明，SLC 对 3种乳腺癌细胞的趋化活性和侵袭活性都应该是通过其受体 CCR7介导的. 表 3CCR7的封闭对乳腺癌细胞趋化活性的抑制（略）表 4CCR7的封闭对乳腺癌细胞侵袭活性的抑制（略） 3 讨论 在生理状况下，趋化因子及其受体对血细胞在体内的迁移与定位发挥重要的调节作用6. 然而近来研究发现，趋化因子及其受体在恶性肿瘤器官特异性转移中也同样发挥关键性作用7. 一般认为，不同的器官由于存在不同的趋化因子，对特异性
16、表达相应受体的肿瘤细胞产生不同的趋化或募集作用，从而导致肿瘤细胞选择性地向相应器官转移. 其中研究最多的是趋化因子受体 CXCR4，它的配体 SDF1在淋巴结、肺脏、肝脏、骨髓等器官中高表达，肿瘤细胞表达 CXCR4被认为与多种恶性肿瘤的淋巴结转移、肝转移、肺转移、以及骨髓转移密切相关，其中就包括乳腺癌1 、前列腺癌8 、淋巴瘤9 、神经母细胞瘤10等. CCR6的配体 CCL20在肝脏高表达，CCR6 的表达可以介导恶性肿瘤细胞向肝脏转移11 ；表达 CCR10的恶性黑色素瘤可以向表达相应配体 CTACK的皮肤特异性转移1. 对于趋化因子受体 CCR7，其配体 SLC、ELC 主要在淋巴结中
17、特异性高表达，生理状况下 CCR7及其配体介导淋巴细胞向淋巴结迁移与归巢. 然而 Mashino等3研究却发现，大约 2/3的胃癌组织也表达 CCR7，并且 CCR7的表达与胃癌淋巴结转移密切相关；Takanami4研究证实，CCR7 的表达是一项与淋巴结转移相关的小细胞肺癌的独立预后因素，但是在乳腺癌中，尚没有类似的临床病理研究证据. 我们推测 CCR7及其配体可能也参与了乳腺癌细胞向淋巴结特异性转移的过程. 我们体外研究结果证实： 乳腺癌细胞系也表达不同程度的 CCR7；CCR7的配体 SLC在体外可以促进乳腺癌细胞的趋化与侵袭，并且该两种活性均可以通过 CCR7受体的封闭而被抑制；另外，
18、趋化活性与侵袭活性的强弱与乳腺癌细胞 CCR7的表达水平可能相关，在 MDAMB361细胞中 CCR7表达高，表现出的趋化活性与侵袭活性也比较强. 这些结果表明，CCR7 及其配体促进了乳腺癌细胞的趋化与侵袭. 而趋化活性和侵袭活性正是恶性肿瘤转移的基本特性，CCR7 的表达可能就促使了乳腺癌细胞向表达相应配体的淋巴结特异性转移，当然结论的得出还需要进一步的体内研究和临床证实. 我们早期的预实验还发现，配体（SLC）的浓度明显与乳腺癌细胞的趋化活性和侵袭活性相关，浓度过高或者过低均会影响趋化活性和侵袭活性，理想的 SLC浓度是 50500 nmol/L. 这一现象在 SLC对 T淋巴细胞的趋化
19、中已经发现12 ，50500 nmol/L的浓度范围也恰恰就是 SLC对T细胞的最佳趋化浓度13. 这在一定程度上也说明，CCR7 及其配体对恶性肿瘤细胞趋化活性与侵袭活性的调控也是精细的，肿瘤细胞可能就是巧妙地借鉴了淋巴细胞正常的归巢机制而实现其向淋巴结特异性地转移. 但是乳腺癌细胞 CCR7的表达是如何被调控的，CCR7 在淋巴结转移动态过程中如何具体发挥作用，以及 CCR7的表达能否成为特异性评价乳腺癌淋巴结转移潜能的新的分子标志物,或者预后因素等等问题尚待进一步解决14. 【参考文献】 1Mller A, Homey B, Soto H, et al. Involvement of c
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