1、缺血后处理对大鼠肾脏缺血再灌注后肾小管上皮细胞超微结构的影响【摘要】 目的: 观察缺血后处理对大鼠缺血再灌注后肾小管上皮细胞超微结构的影响. 方法: 将 24 只 SD 大鼠随机分为假手术组（S 组） 、缺血再灌注组（IR 组）和缺血后处理组（IPO 组） ，每组 8 只. 分别建立动物模型. IR 组在同时夹闭双侧肾动脉 45 min 后恢复血供，IPO 组在肾缺血 45 min 后采用反复 10 次再灌注 20 s-缺血 20 s 的后处理方法. 恢复血供 24 h 后留取各组大鼠肾组织标本，在透射电镜下观察肾小管上皮细胞超微结构变化，分别计算微绒毛、细胞器、细胞核的超微病变指数. 结果:
2、 IR 组大鼠肾小管上皮细胞表现出不同程度的变性、坏死、崩解，IPO 组大鼠肾小管上皮细胞可见变性、凋亡，较少见坏死及崩解. 对病变指数分析提示，其微绒毛、细胞器、细胞核等超微结构改变均较 IR 组轻. 结论: 缺血后处理可以减轻缺血再灌注后肾小管上皮细胞的损伤，减少细胞坏死，稳定线粒体等细胞器结构，从而减轻急性肾脏 IR 损伤. 【关键词】 缺血预处理 肾小管上皮细胞 缺血再灌注 鼠 超微结构 0 引言 临床上，在出现低血容量性休克、急性肾动脉阻断的情况下以及进行肾脏移植的过程中，常可导致急性肾脏缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI） ，进而造成急
3、性肾衰竭或使移植肾功能延迟恢复1. 已有研究2证实在大鼠肾脏恢复灌注之前进行反复多次的短暂缺血再灌注，即缺血后处理（ischemic postconditioning, IPO） ，可以减轻急性肾脏 IRI，但其机制尚不完全清楚. 我们通过对大鼠缺血再灌注后肾小管上皮细胞超微结构变化进行观察和分析，探讨 IPO 减轻急性肾脏 IRI 的机制，为临床有效防治急性肾脏 IRI 提供依据. 1 材料和方法 1.1 材料健康雌性 SPF 级 SD 大鼠 24 只，体质量（23610） g，由第四军医大学实验动物中心提供，动物许可证号 SCXK（军 2002005 ） ，标准饲料喂养，正常饮水，普通光照
4、. LKBNova 型超薄切片机（DAKO公司） ，JEM100SX 型透射电镜（日本 JEOL 公司）. 1.2 方法 1.2.1 动物分组及模型制作将 SD 大鼠随机分为假手术组（S 组） 、缺血再灌注组（IR 组）和缺血后处理组（IPO 组） ，每组 8 只. 缺血再灌注模型：参考文献3的方法，将大鼠用 30 g/L 戊巴比妥腹腔以 30 mg/kg 注射麻醉，固定、去毛，沿上腹部正中线逐层切开皮肤、腹直肌及腹膜，先后在结肠脾区及结肠肝区位置暴露左、右肾脏，游离左、右肾蒂，用玻璃分针小心分离出左、右肾动脉，然后用血管夹同时将双侧肾动脉夹闭，45 min 后同时松开双侧血管夹，恢复双侧肾脏
5、血供. 缺血后处理模型：手术方法同 IR 组，在缺血 45 min 后用血管夹同时给予双侧肾脏反复 10 次的恢复血供 20 s-阻断血供 20 s 处理，再恢复血供. S 组：手术方法同 IR 组，仅分离出大鼠双侧肾动脉，不夹闭双侧肾动脉. 1.2.2 标本留取及处理在末次恢复肾脏血供 24 h 后，自肾动脉用冰生理盐水对肾脏进行灌洗直至肾脏发白，取下双肾，迅速留取合适大小组织于 30 g/L 戊二醛进行前固定，之后用 10 mmol/L 磷酸缓冲液浸洗 3次，每次 10 min，然后用 10 g/L 锇酸后固定 2 h，经磷酸缓冲液浸洗后，梯度乙醇脱水，浸透，Epon812 环氧树脂包埋，
6、半薄切片光镜定位，LKBNova 型超薄切片机切片，铀铅染色后，JEM100SX 型透射电镜观察. 1.2.3 指标观察单盲下观察肾小管上皮细胞超微结构变化，并作量化分析. 具体方法为：各组中每只大鼠均随机选择 1 张切片，从左至右连续计数 20 个细胞，分别记录有微绒毛病变（肿胀，坏死和崩解的微绒毛，刷状缘消失等） 、细胞器病变（包括髓样小体，异噬溶酶体，残余小体，肿胀和变性的线粒体、内质网等）和细胞核病变（包括核畸形，巨核，核仁缺失，染色质深染，染色质边集，核膜增生卷曲等）的细胞数，将二者的百分比作为其超微病变指数，各组取其平均值进行统计分析. 统计学处理：所得数据采用 xs 表示，采用完
7、全随机设计的单因素方差分析（ANOVA） ，多组之间两两比较采用 LSDt 检验，应用 SPSS 13.0 软件进行统计学处理，以 P0.05 为差异有统计学意义. 2 结果 2.1 各组之间肾小管上皮细胞病变指数的比较与 S 组相比，IR，IPO组的微绒毛、细胞器和细胞核等超微结构病变指数差异有统计学意义（P0.01，表 1）. 与 IR 组相比，IPO 组的微绒毛、细胞器和细胞核等超微结构病变明显减轻（P0.01）. 2.2 各组之间肾小管上皮细胞超微结构改变 S 组大鼠肾小管上皮细胞超微结构正常，可见位于细胞腔面的微绒毛排列整齐， 未见肿胀和脱落，基底部细胞膜可见基底褶（图 1A） ；胞
8、质内有大量丰富而成熟的线粒体、内质网等细胞器（图 1B） ；细胞核位于细胞内基底部，核染色质结构正常，核仁明显可见（图 1C）. IR 组电镜下可见大鼠肾小管上皮细胞坏死崩解后形成的颗粒状无结构区，基底膜裸露；残存的肾小管上皮细胞微绒毛坏死、崩解，刷状缘消失，部分残存的微绒毛肿胀呈泡状，细胞基底褶消失（图 2A） ；可见胞质内大量空泡形成，线粒体减少或消失，残存的线粒体大小不等，排列不规则，有嵴脱颗粒现象或髓样变，内质网减少、扩张（图 2B） ；细胞核碎裂，染色质变性，块状聚集，部分凋亡的细胞胞质浓缩、核染色质固缩，聚集于核膜，呈境界分明的块状或新月体小体（图 2C）. IPO 组电镜下较少见
9、肾小管上皮细胞坏死、崩解，可见肾小管上皮细胞微绒毛肿胀，部分微绒毛脱落，基底褶减少，基膜模糊（图3A） ；胞质内细胞器相对完整，线粒体肿胀，内质网扩张，溶酶体增多，空泡形成（图 3B） ；核染色质边聚，较少见特征性的凋亡细胞（图 3C）. 电镜观察结果显示，S 组大鼠肾小管上皮细胞超微结构正常，IR 组大鼠肾小管上皮细胞表现出不同程度的变性、坏死、崩解，IPO 组可见肾小管上皮细胞变性，较少见凋亡、坏死及崩解，细胞器相对完整，超微结构改变较 IR 组减轻.表 1 各组 SD 大鼠肾小管上皮超微结构病变指数的比较 3 讨论 1986 年，Murry 等4报道在急性 IR 发生之前，对心脏进行反复
10、多次的短暂 IR（即缺血预处理）可以减轻心脏的 IRI. 此后，Ogawa 等5证实了预处理对肾脏急性 IRI 同样有保护作用. 然而在临床中如果一旦发生 IRI，则预处理难以实施，因此，一些学者把研究重点转向在缺血后进行干预（即 IPO） ，以期更为有效地防治急性 IRI. 2000 年，我国学者6首先证实了 IPO 对急性心肌 IRI 具有保护作用，随后的一些研究证实，针对肝脏7 、脑8等组织进行 IPO，对其相应器官的 IRI也可产生保护作用. 最近，我们针对大鼠肾脏功能和光镜下形态学改变的研究提示，IPO 同样可以对肾脏急性 IRI 产生保护作用. 已有的研究证实，在体内 IPO 可以
11、减少肝细胞的凋亡或坏死并可以稳定线粒体的超微结构，从而对肝脏 IRI 产生保护作用7 ；在体外 IPO可能通过减少心肌细胞的程序性或非程序性死亡以及减少细胞自溶来发挥其心血管保护作用9. 我们的前期研究工作建立了肾脏 IPO 动物模型2 ，但目前尚未检索到肾脏 IPO 对 IRI 后肾小管上皮细胞超微结构影响的报道. 我们在成功建立大鼠肾脏 IPO 模型的基础上，重点对 IR 组、IPO 组大鼠肾小管上皮细胞超微结构的变化进行了对比观察，结果显示大鼠肾脏 IR 24 h 后可见肾小管上皮细胞坏死、崩解，刷状缘消失，线粒体等细胞器减少或消失，细胞核碎裂，而经过 IPO 的大鼠在 24 h 后肾小
12、管上皮细胞坏死、凋亡、崩解较少见，微绒毛肿胀，线粒体等细胞器相对完整，统计学分析提示 IPO 组大鼠的微绒毛、细胞器、细胞核等超微结构病变均较 IR 组显著减轻. 我们的结果提示 IPO 可以减轻 IR 大鼠肾小管上皮细胞的损伤，减少细胞坏死和凋亡，稳定细胞器和细胞核结构，从而减少因 IRI 造成的肾小管上皮细胞功能的丧失，对急性肾脏 IRI 产生保护作用. 致谢本实验得到了第四军医大学基础部病理学教研室刘健教授，电镜中心王春梅教授、黄晓峰教授的大力协助与支持，特此致谢. 【参考文献】 1 Perco P, Pleban C, Kainz A, et al. Gene expression a
13、nd biomarkers in renal transplant ischemia reperfusion injuryJ. Transpl Int, 2007, 20(1):2-11. 2 陈光磊, 王汉民, 刘广厚, 等. 大鼠急性肾脏缺血再灌注后处理动物模型的建立J. 第四军医大学学报, 2007, 28(9):812-814. 3 Basile DP. Rarefaction of peritubular capillaries following ischemic acute renal failure: A potential factor predisposing to pro
14、gressive nephropathyJ. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2004, 13(1):1-7. 4 Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardiumJ. Circulation, 1986, 74(5):1124-1136. 5 Ogawa T, Mimura Y, Hiki N, et al. Ischaemic preconditioning ameliorates
15、 functional disturbance and impaired renal perfusion in rat ischaemiareperfused kidneysJ. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2000, 27(12):997-1001. 6 陶凌, 李源, 高峰, 等. 缺血后处理对急性心肌缺血再灌注兔心脏的保护作用J. 第四军医大学学报, 2000, 21(6): S116-S118. 7 Sun K, Liu ZS, Sun Q. Role of mitochondria in cell apoptosis during hepatic isch
16、emiareperfusion injury and protective effect of ischemic postconditioningJ. World J Gastroenterol, 2004, 10(13): 1934-1938. 8 Danielisova V, Nemethova M, Gottlieb M, et al. The changes in endogenous antioxidant enzyme activity after postconditioningJ. Cell Mol Neurobiol, 2006, 26(78): 1181-1191. 9 Dosenko VE, Nagibin VS, Tumanovskaya LV, et al. Postconditioning prevents apoptotic necrotic and autophagic cardiomyocyte cell death in cultureJ. Fiziol Zh, 2005, 51(3):12-17.
