1、人 RHD 基因结构研究及意义者：周华友，兰炯采，王晓珠，樊红，孟庆宝，张印则，王从容 【关键词】 聚合酶链反应 【Abstract】 AIM: To analyze structure of RHD gene, emphasizing on detecting promoter of RHD gene, and to investigate mechanism of RHD expressing. METHODS: 60 samples of unrelated RhD(+) Hans, 98 samples of RhD(-) Hans and 2 samples of weak D we
2、re detected by PCRSSP with 3 pairs of primers. RESULTS: Promoters of individuals with RhD (-) phenotype /RHD (-) genotype were absent, while promoters of the RhDnegative individuals carrying the partial or intact RHD gene were present. CONCLUSION: Deletion of RHD gene in individuals with RhD (-) phe
3、notype /RHD (-) genotype responds for mechanism of RHD negative , and there may exist another mechanism of RhD negative in individuals with RhD (-) phenotype and RHD partial deletion or nondeletion. 【Keywords】 RHD genes; promoter regions (genetics); polymerase chain reaction sequence analysis; DNA p
4、rimers; phenotype; genotype 【摘要】 目的： 研究 RHD 基因结构，重点检测启动子区，探究 RHD基因的表达机制. 方法： 采用 PCRSSP 方法，设计 3 对序列特异性引物，对 60 例无血源关系 RhD(+)汉族人样本、98 例无血源关系 RhD(-)汉族人样本和 2 例弱 D 型汉族人样本 RHD 基因启动子区约 1000 bp 范围内的 4个 RHD 基因特异性多态性位点进行检测. 结果： RhD 表型(-)/RHD 基因型(-)个体启动子区全缺失，表型 RhD 阴性基因型为部分缺失或不缺失型个体启动子区都不缺失. 结论： RhD 表型(-)/RHD 基
5、因型(-)个体符合RhD 阴性的普遍机制，表型 RhD 阴性基因型为部分缺失或不缺失型个体存在另一种 RhD 阴性机制. 【关键词】 RHD 基因；启动区（遗传学） ；聚合酶链反应序列分析；DNA 引物；表型；基因型 0 引言 人类 Rh 血型系统（Rh 血型系统中基因以 RH 表示，抗原以 Rh 表示）是临床最重要的血型系统之一，也是人类 29 个红细胞血型系统中最复杂最富有多态性的一个系统，该系统抗原抗体不相容能引起溶血性输血反应、新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血1-3. Rh 血型抗原由位于1 号染色体短臂 1p34.3-1p36.1 上两个紧密连锁高度同源的 RHD 和 RHCE基因
6、编码，这两个基因序列同源性高达 96%97%，都含有 10 个外显子，RHD 基因编码 RhD 多肽，RHCE 基因编码 RhC/c 和 RhE/e 多肽. 在绝大多数高加索人种中，RhD 阴性个体 RHD 基因全缺失，这代表了 RhD 阴性的普遍机制，对 RH 基因的深入研究证明 RhD 阴性多态性存在丰富的种族背景差异，可能有多种 RhD 阴性机制存在4-6. 我们采用 PCRSSP 方法对RhD 阴性样本的 RHD 基因的结构进行了检测，重点检测了启动子区，探讨了汉族人 RHD 基因的表达机制. 1 材料和方法 1.1 材料 10 份 RHD+/RHD+型、10 份 RHD+/RHD-型
7、和 10 份 RHD-/RHD-型标准DNA 样本由美国国立卫生研究院免疫遗传实验室提供. 60 例无血源关系RhD(+)汉族人样本由广州市血液中心提供；98 例无血源关系 RhD(-)汉族人样本和 2 例弱 D 型汉族人样本由秦皇岛市中心血站、锦州市红十字中心血站、深圳市人民医院输血科和广东省人民医院输血科提供. Taq DNA聚合酶和 DNA Marker 由大连 TAKARA 公司提供，德国 Biometra T1 型PCR 扩增仪和 Biometra 恒温恒压电泳仪，SYNGENE 公司产 Gene Genius 型凝胶成像系统. 1.2 方法 1.2.1RhD 表型检测聚凝胺法检测
8、RhD 表型，抗 D 试剂为美国Immuncor 公司和 Domining 生物公司的单克隆和多克隆抗血清. 聚凝胺法RhD 阴性样本用改良抗人球蛋白实验确认. 改良抗人球蛋白实验 RhD 阴性样本用三氯甲烷/三氯乙烯做吸收放散试验 ,以确定是否为 Del 型(Absorption/elution, Del 型). 1.2.2 基因组 DNA 的制备使用美国 G T 公司基因组 DNA 快速抽提试剂盒 ,采用盐析法从供血者外周血分离获得: 0.3 mL EDTA 抗凝外周血加 1 mL 红细胞裂解液 ,离心弃上清 ,沉淀加入 170 L 核裂解液及 4 L SDS,剧烈振荡 ,再加入 72 L
9、 5 mol/ L NaCl 溶液 ,12 000 g 离心 5 min,取上清加入 210 L 异丙醇沉淀 DNA,将 DNA 溶于 50100 L TE 溶液中,4保存待用. 1.2.3RHD 基因结构区 PCRSSP 法检测启动子区检测： 12.5 L PCR 反应体系组成： 50200 ng 基因组 DNA，1Buffer(50 mmol/L KCl, pH 8.0 的 10 mmol/L TrisHCl)，1.5 mmol/L MgCl2, 200 mol/L dNTPs，检测引物浓度 0.2 mol/L，以扩增人生长激素基因（HGH）一段434 bp 产物作为内对照，内对照引物浓度
10、 0.08 mol/L，8.335 nkat Taq DNA 聚合酶. 循环参数： 95预变性 5 min，然后 30 个循环：94 30 s, 56 30 s, 72 30 s, 最后 72延伸 5 min，4保存. 电泳： 20 g/L 琼脂糖凝胶（含 0.5 mg 溴化乙锭 / L 胶） ，10 L PCR 扩增产物点样，58 V/cm 电压电泳 30 min，凝胶成像. 引物序列见 Tab 1.表 1RHD 基因启动子区 PCRSSP 方法所用引物序列（略） 2 结果 10 份 RHD+/RHD+型标准 DNA 检出上、下游 Rhesus 盒，无杂合 Rhesus盒，即 RHD 基因双
11、基因型，10 份 RHD+/RHD-型标准 DNA 检出上、下游Rhesus 盒和杂合 Rhesus 盒，即 RHD 基因单基因型，10 份 RHD-/RHD-型标准 DNA 只检出杂合 Rhesus 盒无上、下游 Rhesus 盒，即 RHD 基因全缺失型，以上结果与标准品型别一致(Fig 1). 98 例无血源关系 RhD(-)汉族人样本中 54 例（55.1%）只检出杂合Rhesus 盒无上、下游 Rhesus 盒（RHD-/RHD-型） ，即 RHD 基因全缺失型，36 例（36.7%）同时检出上、下游和杂合 Rhesus 盒（RHD+/RHD-型） ，即RHD 基因单基因型，8 例（
12、8.2%）只检出上、下游 Rhesus 盒无杂合Rhesus 盒（RHD+/RHD+型） ，即 RHD 基因双基因型. 在 98 例 RhD 阴性样本中检出 16 例 Del 型，这 16 例 Del 型中 10 例（62.5%）同时检出上、下游和杂合 Rhesus 盒（RHD+/RHD-型） ，6 例（37.5%）只检出上、下游 Rhesus 盒无杂合 Rhesus 盒（RHD+/RHD+型）. 2 例弱 D 型样本均检出 RHD 基因的 10 个外显子； 98 例 RhD 阴性样本中，54 例（55.1%）RHD 基因全缺失型样本都没有检出任何 RHD 基因外显子，36 例（36.7%）R
13、HD+/RHD-型，即 RHD 基因单基因型中 24 例检出 RHD 基因10 个外显子（非缺失型） ，12 例为外显子部分缺失型；8 例（8.2%）RHD+/RHD+型，即 RHD 基因双基因型中 6 例均检出 RHD 基因的 10 个外显子，2 例只检出 RHD 基因的第 1, 2 和第 10 个外显子（RHDCE(29)D2 型,） ；16 例 Del 型均检出 RHD 基因的 10 个外显子(Fig 2). 10 份 RHD-/RHD-型标准 DNA 以及 98 例无血源关系 RhD(-)汉族人样本中的 54 例（55.1%）RHD-/RHD-型样本，即 RHD 基因全缺失型样本用 3
14、 对特异性引物扩增 RHD 基因启动子区都扩增不出特异带；60 例无血源关系RhD(+)汉族人样本用 3 对特异性引物扩增 RHD 基因启动子区均扩增出 3条特异带(256, 221 和 123 bp)，10 份 RHD+/RHD-型标准 DNA 和 98 例 RhD阴性样本中 36 例（36.7%）RHD+/RHD-型，即 RHD 基因单基因型样本用 3对特异性引物扩增 RHD 基因启动子区均扩增出 3 条特异带；10 份RHD+/RHD+型标准 DNA 和 98 例 RhD 阴性样本中 8 例（8.2%）RHD+/RHD+型，即 RHD 基因双基因型样本用 3 对特异性引物扩增 RHD 基
15、因启动子区均扩增出 3 条特异带；2 例弱 D 型样本和 16 例 Del 型样本用 3 对特异性引物扩增 RHD 基因启动子区均扩增出 3 条特异带(Fig 3). 3 讨论 RHD 和 RHCE 基因紧密连锁串联排列，用不同的 DNA 链作编码链，所以方向相反，基因排列顺序为 RHDCE，两个基因相隔 30 000 bp. 两个基因之间还有 1 个 SMP1 基因，该基因方向同 RHD 基因. RH 基因结构见 Fig 4. 近年关于 DR 的实验研究中，Joussen 等6发现链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠在 1 wk 就出现了视网膜血管内皮细胞的损伤和死亡；Yamashiro 等7发现糖尿
16、病大鼠在 2 wk 出现了视网膜微血管系统血小板微血栓的聚集和内皮细胞的死亡；Park 等15发现糖尿病大鼠在1 wk 出现了视网膜水平细胞突触后突起的变性，在 4 wk 出现了节细胞的坏死；Barber 等8发现糖尿病大鼠在 1 mo 时视网膜平铺片 TUNEL 法标记凋亡细胞的数量比正常鼠增加 10 倍以上. 这些研究把以前糖尿病模型的研究时间点3-5大大提前，为探索人类糖尿病的早期预防和治疗起了十分重要的提示作用. 这些病理变化的出现预示着视网膜电生理功能不可避免地出现改变. Li 等16发现糖尿病大鼠最早在 2 wk 时 ERG的振幅就比对照组减少，且糖尿病对 ERG b 波的影响大于
17、对 a 波的影响. 本实验中，我们观察到糖尿病大鼠在早期阶段出现了视觉电生理功能的改变，表现为视网膜电图的潜伏期变化显著，潜伏期在 2 wk 以后比对照组明显延长，但始终未出现振幅的改变. 与 Li 等16的实验相比，我们的实验仅发现 ERG 潜伏期有变化，没有发现 ERG 的振幅有变化，推测可能由于我们实验模型的血糖值要求较低，短期内对视网膜代谢的损坏程度轻微，因而没有检测到 ERG 振幅发生变化. 但是，我们和 Li 等16的研究都支持糖尿病大鼠在早期确实发生了视觉电生理功能的改变，这些提示我们应当把 ERG 检查作为监测 DR 早期发展的有效指标. DR目前仍无特效药物治疗，临床常用的定
18、期眼底荧光血管造影也只能监测DR 晚期是否造成了大面积毛细血管闭塞，因此对 DR 的早期诊断和对症治疗以延缓视觉功能的渐进性损失显得更为重要，糖尿病早期 ERG 潜伏期的延长有可能成为监测 DR 早期发展的指标. 【参考文献】 1 Frank RN. Diabetic retinopathy J. N Engl J Med, 2004; 350(1): 48-58. 2 Garner A. Histopathology of diabetic retinopathy in man J. Eye, 1993; 7(2): 250-253. 3 Sima AA, Chakrabarti S, Ga
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26、al and morphological observations J. Exp Eye Res, 2002; 74(5): 615-625.在 RHD 和 RHCE 基因之间以及 RHD 上游分别有 1 个 Rhesus 盒（Rhesus box） ，大小约 9000 bp，RHD 基因上下游的 Rhesus 盒方向同RHD 基因，上游 Rhesus 盒(RHD 的 5端)约 9142 bp，终止于距 RHD 起始密码子 4900 bp 位置，下游 Rhesus 盒（RHD 的 3端）约 9145 bp，始于RHD 终止密码子后 104 bp 位置，这两个 Rhesus 盒序列同源性高达98
27、.6%，在 Rhesus 盒的 5701 bp 和 7163 bp 之间有 1 个 1463 bp 的等同区（identity region） 7. 在高加索人种中，绝大多数 RHD 基因的缺失是由 RHD 基因高度序列同源的上下游 Rhesus 盒触发的不等交换（cross over）引起. 断裂点区域位于上下游的等同区内，断裂融合产生 1 个杂合 Rhesus 盒(Hybrid box)，杂合 Rhesus 盒包含 RHD 基因上游Rhesus 盒的 5端和下游 Rhesus 盒的 3端，上下游间的 RHD 基因完全缺失7. 在两个基因的 5端侧翼序列存在红系特异性调控序列，该序列中包含启
28、动子序列，使 RhD, RhC/c 和 RhE/e 在红系中定向表达8. 现已发现的 RhD 阴性多态性种族背景差异主要有以下几种： RHD基因全缺失（gross deletion） ，RHD 基因部分缺失（partial deletion） ，RHD 基因不缺失（nondeletion） ，RHD 假基因和 RHDCED 杂合基因等4-6. 对表型为 RhD 阴性中国人 RHD 基因结构初步研究表明： 弱 D表型和 Del 型个体 RHD 基因结构基本正常，表型为 RhD 阴性个体中50%65%的个体 RHD 基因全缺失，15%30%个体 RHD 基因部分缺失，10%25%个体 RHD 基因
29、不缺失，抗人球蛋白试验阴性个体中约 30%的人拥有 RHD 基因，吸收放散试验阴性个体中约 10%的人携带 RHD 基因9,10 ，本研究结果与此相符. 这些研究结果表明，在表型为 RhD 阴性中国人有相当一部分人拥有 RHD 基因但不表达或表达水平极低以至于用常规抗血清方法无法检测到11. 启动子是在基因转录起始位点（+1）及其 5上游近端的一组具有独立功能的 DNA 序列，是决定 RNA 聚合酶转录起始和转录频率的关键元件，对基因的转录表达起着极其重要的作用. 本研究中我们用 PCRSSP 方法，设计三对特异性引物，重点检测 RHD 基因启动子区约 1000 bp 范围内的 4 个 RHD 基因特有的多态性位点. 结果表明 RhD 表型(-)/RHD 基因型(-)个体启动子区全缺失，这部分个体符合 RhD 阴性的普遍机制，但表型为 RhD 阴性基因型为部分缺失或不缺失型个体启动子区都不缺失，这提
