1、人端粒酶逆转录酶基因 RNAi 表达载体的构建、鉴定作者：毛立军，郑骏年，李望，郑宏祥，刘俊杰，孙晓青，陈家存，温儒民 【关键词】 重组质粒 摘要 :目的 构建端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的 RNA 干扰（RNAi）表达载体。 方法 化学合成能编码针对 hTERT 基因的短发夹RNA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火处理后克隆到 pSilencer1.0-U6shRNA 表达载体的 U6RNA 聚合酶（Pol）启动子的下游，构建重组RNAi 质粒 pSliencer-hTERT。 结果 经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点。 结论 已成功构建 pSliencer-hTERT
2、 载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。 关键词 :RNA 干扰;短发夹 RNA;人端粒酶转录酶;重组质粒; Abstract:Objective To construct the expressing vector of small hairpin RNA（ shRNA）targeting human telomerase re-verse transcriptase（hTERT）gene.Methods Two template DNA oligonucleotides for shRNA expression targeted hTERT gene were chemica
3、lly synthesized.The annealed shRNA templates were processed to produce and identify the recombinant RNAi plas-mid sPilencer-hTERT.Results It was demonstrated that shRNA template targeting hTERT gene had been inserted at the ex-pected site and the insertion sequence was perfectly correct.Conclusion R
4、NAi expression vector targeting hTERT gene has been constructed successfully and will be used as a useful method to develop specific hTERT-silencing therapeutics. Key words:RNA interference;small hairpin RNAs;human telomerase reverse transcriptase;recombinant plasmid 端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，通过激活端粒酶，端粒
5、 DNA 得以延长使细胞永生。端粒酶逆转录酶（hTERT）是催化这一反应的惟一限速酶，因此有希望成为肿瘤治疗的理想靶点。RNA 干扰是近年迅速发展起来的一项新的基因阻断技术，能特异、高效地阻抑靶基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具1 。本实验将针对 hTERT mRNA的小干扰 RNA（siRNA）模板插入 siRNA 表达载体，构建载体 hTERT-siRNA 表达载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 pSilencer1.0-U6 质粒为美国 Am-bion 公司产品，大肠杆菌 JM109 由徐州医学院生物化学教研室保存。T4DNA 连
6、接酶以及小量质粒提取试剂盒购自 Promega 公司，限制性内切酶 BamH 和 Hind购自 MBI 公司。 1.2 实验方法 1.2.1 模板 DNA 合成 选择 2 段 hTERT mRNA 的序列作为 RNA 干扰的靶序列，序列一针对的是 hTERT 基因显性失活突变体区（NM003219:碱基序列位置 2182-2200） 。序列二采用 Ambin 公司的网上设计软件（）进行设计，所对应的的靶序列为hTERT（NM003219:747-765） 。设计 2 对编码短发夹 RNA 序列的 DNA 单链。序列一:P1:5-CAAGGTGGATGTGACGGGCTTCAAGAGAGCCC-
7、GTCACATCCACCTTGTTTTTT-3，P2:5-AATTAA-AAAAGCCCGTCACATCCACCTTGTCTCTTGAACAAG-GTGGATGTGACGGGCGGCC-3。序列二:P1:5-GTCTGCCGTTGCCCAAGAGTTCAAGAGACTCTTGGG-CAACGGCAGACTTTTTT-3，P2:5-AATTAAAAA-AGTCTGCCGTTGCCCAAGAGTCTCTTGAACTCTTGG-GCAACGGCAGACGGCC-3。其顺序为 Apa酶切位点、19nt 正义序列、9nt loop 接头序列、19nt 反义序列、RNA 聚合酶终止子（6 个 T） 、Ec
8、oR酶切位点。单链两端包含保护碱基和 EcoR（AATT）以及 Apa（GGCC）酶切残基，能直接与pSilencer1.0-U6siRNA 线性表达载体连接。由 Introvigen 生物公司合成。1.2.2 质粒 pSilencer-hTERT 表达载体的构建 1.2.2.1 寡核苷酸的退火 将合成的模板寡核苷酸溶解在 100l 无核酶水中，取 1l 用 TE（10mmol.LTris，1mmol.L EDTA）稀释，使终浓度为 1g.L。取正义模板链、反义模板链各 2l 加入 46l 的退火缓冲液，在 90孵育 3min，37孵育 1h。退火后形成的双链用 3%凝胶电泳，以10 倍稀释的
9、合成的单正链为对照，检测退火前后电泳图谱是否有变化。 1.2.2.2 寡核苷酸与 pSilencer1.0-U6 连接 将针对不同 hTERT 序列的 2 对退火后的模板链与 pSi-lencer1.0-U6 线性表达载体连接，重组后的载体命名为 pSilencer-hTERT1、pSilencer-hTERT2。按下列操作进行:取 5l 退火后的模板链用 45l 无核酶水稀释成终浓度 8mg.L，建立10l 反应体系:1l 上述稀释退火模板链、6l 无核酶水、1l10T4DNA 连接酶缓冲液、1l pSilencer1.0-U6、1l T4DNA 连接酶（5U.l） 。16孵育过夜。将重组载
10、体转化感受态细胞 JM109 后提取质粒。 1.2.3 阳性克隆鉴定 1.2.3.1 酶切鉴定 用 BamH或 Hind单酶切重组质粒，所有各管于 37水浴过夜。取 7l 样品在 1%琼脂糖凝胶和 TAE 缓冲液中 80V 电泳 0.5h 观察结果。阳性克隆应该不能够被 Hind单酶切，但可被BamH切出大约 370bp 的小条带。 1.2.3.2 测序鉴定 将 BamH和 Hind酶切后电泳出现大约 370bp的阳性重组质粒送到上海英俊生物工程有限公司测序。 2 结果 2.1 退火寡核苷酸与单链寡核苷酸电泳结果 从电泳图（图 1）可见，退火前后寡核苷酸电泳图谱明显不同。Lane1 条带位置在
11、 100bp 之前，约60bp 左右。Lane2 电泳图谱出现 3 条带，前面的 2 条与 Lane4 的 2 条带相似，前面的应该是单链寡核苷酸，后面的可能是 2 条单链的自身的连接，另一条带在 100bp 位置上，可能是单链自身折叠形成了发夹结 构，虽然分子量缩小，但由于发夹结构这种构象的改变，导致了电泳迁移速率放慢。Lane3 与 Lane1 相似，而 Lane4 出现 2 条带，前面的应该是单链寡核苷酸，后面的可能是 2 条单链的自身的连接。从电泳图可见序列一的单链自身折叠以及 2 条单链的自身的连接程度比序列一明显得多。 图 1 退火寡核苷酸与单链寡核酸电泳图（略） 1、2 分别是序
12、列一退火后、单链核苷酸;3、4 分别是序列二退火后、单链核苷酸;M 为 marker 2.2 重组质粒酶切结果 将菌落扩增后提取质粒，酶切鉴定结果显示:2 条序列构成的重组质粒都不能被 Hind单酶切，但可被 BamH切出大约 350bp 大小的片段（图 2） 。 图 2 重组质粒酶切电泳图（略） 1、2 分别是序列一、二的重组质粒;3、4 分别为 Hind酶切后重组质粒;5、6 分别为 BamH酶切后重组质粒 2.3 测序结果 由序列一构成的重组的阳性 RNAi 载体反复测序时信号都无法通过造成测序失败，由序列二构成的重组的阳性 RNAi 载体测序的结果，与我们设计合成的靶向 hTERT 的
13、正义链完全一致，说明本实验已把合成的寡核苷酸插入到了 RNAi 载体 pSilencer1.0-U6siRNA 中，成功构建了能靶向端粒酶 hTERT 基因的 pSilencer1.0-U6siRNA 载体。 3 讨论 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是由于与靶基因序列同源的双链 RNA（dsRNA）引发的序列特异性转录后基因沉默过程，该技术已成为生物学研究进展最快的领域之一。最初是利用化学合成的 siRNA 实现RNAi，但 siRNA 作用时间短暂，进入细胞后很快被降解，24h 后阻抑效果降低，作用持续时间约 48h。为克服此缺陷，人们设想出利用载体介导siRNA
14、 体内表达技术，其原理是将 siRNA 对应的 DNA 模板插入载体中位于RNA 聚合酶启动子下游，在 RNA 聚合酶作用下转录产生含发夹状结构的 siRNA（shRNA） 2 。据此，Brummelkamp3 设计出针对靶基因的 siRNAs 的模板 DNA，将其与质粒连接后转染细胞，结果 DNA 模板在细胞内转录形成的 shRNA 具有与 siRNA 同样的抑制靶基因表达作用，更为重要的是这种作用可持续 2 个月。 siRNA 序列的选择常遵循如下规则:其长度通常为 1921 个碱基，一般从基因编码序列或 cDNA 序列的起始密码开始，向下游寻找腺苷二核苷酸（AA） ，标记并选择每个 AA
15、 及其下游邻近的 19 个核苷酸序列一起作为siRNA 的靶序列。在设计 siR-NA 的过程中，要避开 cDNA 的 5和 3非编码区（un-translated regions，UTRs）以及 5起始密码区附近50100 个核苷酸的序列，因为在这些区域含有丰富的蛋白结合位点，结合的调节蛋白以及形成的翻译起始复合物等可以影响 siRNA 与 dsRNA 诱导的沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC）结合到靶mRNA 上4 。所选择的 siRNA 序列必须进行全基因组扫描（BLAST）和序列同源分析。 本实验设计的 siRNA 模板序列顺序为:正义链
16、（19nt）loop 环区（TTCAAGAGA）反义链（19nt）RNA 聚合酶终止子（TTTTTT） 。所用载体为:当其插入 pSilencer1.0-U6 线性化质粒 U6 启动子下游后，在 RNA聚合酶作用下转录产生含发夹状结构的 siRNA，当转录至模板上的一连串 T 时转录终止。 本实验选择的序列二经酶切、测序鉴定证实成功构建了 hTERT siRNA表达质粒 pSliencer-hTERT。采用的序列一曾被 Kosciolek 等5 作为靶序列化学合成 siRNA，并且在肿瘤细胞中证明有效。本实验以此序列构建载体，酶切证实 siRNA 模板已插入载体，但在重组质粒测序的过程中，反复
17、出现没有信号的现象，分析其原因可能是由于 G.C 含量过高，形成二级结构使测序信号无法通过造成的。在序列设计的过程中还要注意尽量避免 G.C 含量较高的序列，最好选择在 40%45%，G.C 含量超过 55%时的 siRNA 诱导的 RNAi 的效果较差。 参考文献 : 1 Fire A， Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic in-terference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegansJ.Na-ture，1998，391（6669）:806-811. 2 Sui
18、 G，Soohoo C，Affarel B，et al.A DNA vector-based RNAi techno.logy to suppress gene expression in mammalian cellJ.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（8）:5515-5520. 3 Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expres-sion of short interfering RNAs in mammalian cellJ.Science，2002，296（5567）:550-553. 4 McManus MT，Sharp PA.Gene silencing in mammals bysmall interfer-ing RNAsJ.Nat Rev Genet，2002，3（10）:737-747. 5 Kosciolek BA，Kalantidis K，Tabler M，et al.Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interferenceJ.Mol Cancer Ther，2003，3（2）:209-216.
