1、人合子原核构型及早期卵裂与胚胎发育潜能的关系作者：李瑞文 滕文顶 鲜红 周瑞年【摘要】 目的:探讨胚胎早期卵裂及原核构型能否指导移植胚胎的选择及与胚胎发育潜力之间的关系。方法:根据早期卵裂时间及原核构型不同进行筛选而移植的 129 个体外受精(IVF)、卵胞浆内单精子注射(ICSI)周期，共 1 032 个正常受精卵为资料。根据受精卵原核构型的不同分为四组，结合构型类型及早期卵裂与否进行选择性移植，通过观察优质胚胎率、囊胚形成率、种植率和怀孕率，来评估合子原核构型和早期卵裂与胚胎发育潜力的关系。结果:最常见的原核构型为 PN1(29.58%)及PN2(27.67%)，接着是 PN3(22.38
2、%)和 PN4(20.37%)，而且这些构型与受精方式及精子穿卵的位点无关;与其它种类的原核构型相比，源于 PN1 和PN4 原核构型的合子发育到优质胚胎及囊胚的比例显著增高(P0.05);PN1 和 PN4 原核构型的合子发育成的胚胎，其种植率和怀孕率亦显著升高(P0.05);早期卵裂胚胎与晚卵裂胚胎相比，发育到优质胚及囊胚的胚胎数与种植率、怀孕率均显著增高(P0.05)。结论:合子原核构型与胚胎早期卵裂时间能够指导移植胚胎的选择，对种植率及怀孕率的提高有一定的临床意义。 【关键词】 人;合子;原核构型;早期卵裂;胚胎发育【ABSTRACT】 Objective:To evaluate th
3、e relationship between embryo early cleavage,pronuclei orientation and embryo development potential,and investigate whether it is useful to select the embryo that will be transfered.Methods:In this retrospective study,a total of 1 032 normal zygotes(two pronuclei)from 129 treatment cycles with IVF/I
4、CSI were analyzed.These zygotes were divided into four groups according to the different zygote pronuclei orientation and the developmental potential.Early cleavage rate,embryo quality,the rate of blastocyst,implantation and pregnant rates from these zygotes were observed,and the transferred embryos
5、 were selected according to the pronuclei orientation and early cleavage time.Results:The most common types of pronuclei were PN1(29.58%)and PN2(27.67%),followed by PN3(22.38%)and PN4(20.37%),and this was independent from the fertilizing spermatozoon or its entry point into the oocytes;A significant
6、ly higher proportion of zygotes with PN1 and PN4 types of pronuclei orientation underwent early cleavage and developed into grade embryos and blastocysts compared with other types(P0.05);the implantation and pregnancy rates among patients who received embryos developed from PN1 and PN4 types oocytes
7、 were higher significantly(P0.05).Compared was that of later cleavaged embryo,the number of development into grade ,the blastocyst rates,implantation and pregnant rates of early cleavaged embryo were higher significantly(P0.05).Conclusion:The zygote pronuclei orientation and the time of embryo early
8、 cleavage are useful for the selection of embryo to transfer,it may provide a better guide to the improvement of implantation and pregnancy rates.【KEY WORDS】 Persons,Zygote,Pronuclear orientation,Early cleavage,Embryonic development体外受精(in vitro fertilization，IVF)及胚胎移植(embryo transfer，ET)是目前治疗不孕症的主要
9、手段。影响 IVFET 成功率的因素很多，胚胎质量是最重要的因素之一。任何一个 IVF，其最终目的就是要达到一个较高的种植怀孕率及获婴率，同时尽量避免多胎的发生。为了实现这一目的，一个好的选择胚胎的标准变得越来越需要，特别是在一个移植周期，当有三个以上的一级胚胎可供移植选择时，这种需要变得更加迫切。解决这一问题的方法就是寻找更多有一定预示作用的判断标准，使其能够指导以后的胚胎选择。在以前人 IVF 中，主要是根据第2 或第 3 天胚胎的形态学特征，来挑选优质的胚胎进行移植。卵裂期的胚胎一般根据其形态学特征，如卵裂球的数目，卵裂球的对称性，胚胎的碎片程度等或其它的一些可见的特征分为几个级别。所有
10、的这些评价标准都与胚胎的种植和怀孕有关，它虽然简单易行，不损伤胚胎，但这些方法的总体成功率还是比较低的，因为有 50%以上的移植胚胎没有进行种植1，仍存在一定的局限性。Montfoort(2004)指出，早期卵裂是独立于胚胎细胞形态学和细胞数之外的一种预示因子。为了提高选择胚胎的种植潜力，选择胚胎不应该只依赖移植日的胚胎细胞形态学和细胞数，还应该考虑早期卵裂的发生2。还有报道称将胚胎早期卵裂作为选择胚胎的参数可以提高种植率和妊娠率3。Salumets(2003)等报道，移植单个胚胎时，早期卵裂胚胎的妊娠率可达 50%，而移植非早期卵裂胚胎的妊娠率只有 26.4%4。由此可见早期卵裂在 IVFE
11、T 中可以作为筛选胚胎质量的参数。而合子的原核构型与卵裂之间又存在着一定的关系,卵裂前,原核将会发生旋转并最终平行于极体方向5。本研究的目的就是探讨胚胎早期卵裂及原核构型能否指导移植胚胎的选择及与胚胎发育潜力、种植率、怀孕率之间的关系。1 资料与方法1.1 一般资料本研究材料包括体外受精胚胎移植(IVFET) 和胞浆内单精子注射(ICSI)的不孕症患者 129 个周期,共 1 032 个正常受精的卵母细胞。平均年龄(31.13.4)岁。异常受精的卵母细胞(多原核或单原核)和取卵失败以及取消移植的周期，均未纳入本研究。1.2 方法1.2.1 超排卵采用长方案促排卵：月经黄体期(约周期第 21 天
12、)使用 GnRHa 进行垂体降调节，在月经的 23d 测 E2、FSH、LH 及 B 超监测基础窦卵泡，据激素水平及卵泡情况使用促排卵药物，当卵泡直径达到 18mm 注射HCG，3436h 后在 B 超引导下取卵。1.2.2 精子的准备精液样品以手淫的方法收集于无菌的容器内，液化后，对精液中精子密度、活动性及精子的形态进行评估。根据精子的密度与活力采用梯度离心(300g8min)或直接上游等不同的方法进行处理。经睾丸穿刺获得的睾丸组织经洗涤后粉碎离心(300g8min)，取沉淀精子备用。1.2.3 体外受精(IVF)经阴道穿刺将卵冠丘复合物(OCCCs)取出后，用 HTF 清洗三遍后，置于 H
13、TF 培养皿中(100L/滴，含 10%HSA)预培养，46h 后放入受精液滴中(100L HTF/滴，含 10% HSA)，每个液滴加入 2 00020 000条活动精子，放入 37 ，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养。1.2.4 胞浆内单精子注射(ICSI)ICSI 时，将洗涤好备用的精子加入 5L 10%的 pvp 微滴中，注射的卵母细胞置于 5L 含 10%HSA 的 MHTF 微滴中，上面覆盖石蜡油，用固定针在 9 点钟的位置固定卵母细胞，使极体位于 6 或 12 点的位置，以注射针吸取单个形态正常的活动精子，于 3 点的位置将精子注入卵母细胞内，回吸少量胞浆以确保破膜，后缓慢退出
14、注射针，释放固定的卵母细胞，然后注射下一个，方法同上所述。1.2.5 受精、原核形态学及原核构型的评估取卵 46h 后对成熟卵子进行受精，1618h 后对卵母细胞的受精情况进行检查。在本研究中，当有两个清晰的原核出现时，确认为卵母细胞已受精。并对合子原核进行评分6，同时评估原核与极体的构型关系。对原核构型的评估采用如下方法：将合子置于覆盖石蜡油的MHTF 微滴中，用一根细玻璃管轻轻拨动使其旋转，以便使极体位于 6点钟的位置且原核清晰可见，不重叠。这项操作总共不超过 15s，且对胚胎不会造成损伤。对原核的构型及形态学进行分析并记录，在原核构型的基础上分为以下四种类型：PN1、PN2、PN3 和
15、PN4。PN1 型合子其构型为两原核位于 10：20 或 03：50 的位置，PN2 型合子其构型为两原核位于01：40 或 08：10 的位置，PN3 型合子其构型为两原核位于 06：00 或12：30 的位置，PN4 型合子其构型为两原核位于 02：45 或 09：15 的位置。在移植入子宫之前，我们对以上种类合子进行进一步的评估，分别对受精后 2426、48、72 及 120h 后的胚胎发育进行评估。根据第 3天胚胎的形态学特征进行移植胚胎的选择，在有多余可供选择胚胎的前提下，尽可能选择某一种原核构型和早期卵裂的胚胎，后移入子宫，同时进行黄体支持。在移植后 14d，对血 hCG 水平进行
16、测定，阳性者定为生化妊娠;移植后 2530d，在 B 超下鉴定是否有孕囊及胎心出现，均有则视为临床妊娠。1.3 数据统计分析实验数据以均值标准差(MeanSD)表示。采用 SPSS10.0 统计软件进行显著性检验。P0.05 为差异显著。2 结果2.1 四种不同构型来源的胚胎早期卵裂、优质胚胎、囊胚率的比较1 375 个卵母细胞中,正常受精的有 1 032 个(除去未成熟、未受精及异常受精的卵子)纳入本研究。在 IVF 和 ICSI 病人之间，不同原核构型的比例、受精、卵裂、优胚率及种植怀孕率之间没有显著的差异。具体结果如表 1 所示,由表中可以看出:合子原核构型主要有四种，依次为PN1(29
17、.58%)，PN2(27.67%)，PN3(22.38%)及 PN4(20.37%)。与 PN2，PN3相比，PN1，PN4 来源的胚胎其早期卵裂率、优质胚胎率及囊胚率均显著增加(P0.05),PN2 和 PN3 之间差异均不显著(P0.05)。2.2 原核构型、早期卵裂与种植率和怀孕率之间的关系不同原核构型的合子，其早期卵裂率与种植率和怀孕率之间的关系如表 2 所示，由表中可以看出，与 PN2、PN3 构型的合子相比，PN1 和PN4 构型的合子其早期卵裂率显著增高(P0.05),移植 PN1、PN4 构型和早期卵裂的胚胎其种植率和怀孕率均显著升高(P0.05)。PN2 和PN3 之间各项差
18、异均不显著(P0.05)。表 1 四种不同构型来源的胚胎早期卵裂、优质胚胎、囊胚率的比较注：与 PN2 相比*P0.05，与 PN3相比P0.05 表 2 原核构型、早期卵裂与种植率和怀孕率之间的关系注：与 PN2 相比*P0.05，与 PN3 相比P0.053 讨论胚胎在子宫中能否进行着床并发育，取决于很多因素，包括胚胎质量的好坏，子宫内膜的容受性及胚胎的染色体倍性等遗传学因素是否正常等7，选择什么样的胚胎进行移植是关系到 IVF 成功与否的关键因素之一。因此，能够预示胚胎发育潜力的一些标准变的越来越重要。因而有很多学者从多方面探索一些与胚胎发育和妊娠有关的因素，如受精卵原核的形态及核仁分布
19、及多少，胚胎卵裂的时间，原核与极体的构型关系及是否出现胞浆晕，第 3 天 8 细胞胚胎的数量及胚胎的碎片程度等8。其中方丛(2006)研究表明移植早期卵裂胚胎可以提高 IVFET 的成功率，并提高妊娠率9。由于原核对胚胎的进一步发育及种植和怀孕有一定的预示作用，所以在近来的一些研究中，原核的形态学引起了广泛的关注。在卵裂之前，原核必须平行于极体10，因此我们可以推测原核的构型对卵裂的发生一定存在某种作用，已报道在合子卵裂前，原核将向第二极体方向旋转为合子卵裂做好准备11。因此，本实验通过原核构型与早期卵裂来评估胚胎的质量，以期提高试管婴儿的效率。在 IVF 中，精子从各种不同的方向穿透卵母细胞
20、12，因此，雄原核与雌原核以不同分方式相互靠近，从而形成 PN1、PN2、PN3 和 PN4四种不同的原核构型。但在 ICSI 中，精子是被已固定的方向注入卵母细胞中的，即在 3 点的位置，卵子的极体则位于 6 或 12 点的位置。由于精子是被注射于卵母细胞的中心或稍偏里处，所以以 ICSI 方式受精的所有卵母细胞应该表现为同一原核构型。然而，通过我们的观察，事实却并非如此。所有通过 IVF 或 ICSI 产生的合子，其原核构型均表现出与以上四种相似的情形，且几率基本相同，这些事实说明，合子原核构型的类型与精子的穿透方向是没有关联的，因此可以将原核构型作为评估胚胎发育潜能的指标。在我们的研究中
21、，平行于极体的 PN1 和 PN4 型合子，与 PN2、PN3 型相比，其受精或 ICSI 后 2426h 胚胎的早期卵裂率显著增高(P0.05)。移植早期卵裂发育成的优质胚胎与晚期卵裂的优胚相比，其种植率及怀孕率均显著增高(P0.05)，这与国外的报道一致1314, 在原核消失和卵裂之间，对一部分不同构型的合子每隔几小时进行观察，并未发现原核构型的改变。通过对动物合子的观察发现，在卵裂之前，或者是雌原核移向雄原核，或者是雄原核移向雌原核，最终雌雄原核质膜相互融合，形成二倍体的合子核15。因此，在此期间，原核或纺锤体一定会发生旋转，为卵裂事件的发生做好准备。以第 3 天胚胎的形态学结合原核的构
22、型和早期卵裂与否对移植的胚胎进行选择，结果表明，与 PN2、PN3 构型的合子相比，移植 PN1、PN4 构型和早期卵裂的胚胎其种植率和怀孕率均显著升高(P0.05，表 2);同时，PN1、PN4 来源的胚胎其早期卵裂率，优质胚胎率及囊胚率均显著增加(P0.05，表 1)。本研究通过对原核构型及胚胎质量和发育潜力的观察，来评估原核构型早期卵裂与胚胎发育、种植率和怀孕率之间的关系。提示临床上移植有限的胚胎时，在胚胎评分同样的情况下,可采用合子原核构型及早期卵裂为指标来指导选择植入胚胎。且该研究方法简单，耗时少，对胚胎无损伤,对于选择优质胚胎进行移植，提高种植成活率和试管婴儿效率有一定的意义。【参
23、考文献】1 Scott L.Pronuclear scoring as a predictor of embryo developmentJ.Reprod Biomed Online,2003,6:2012142 Chen C,Kattera S.Comparison of pronuclear zygote morphology and early cleavage status of zygotes as additional criteria in the selection of day 3 embryos:a randomized study J.Fertil Steril,2006
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