1、缺血后处理对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织细胞凋亡及 bcl 2 和 bax 基因表达的影响【摘要】 目的：观察缺血后处理(IPo)对大鼠肾缺血再灌注(I/R)损伤后肾组织细胞凋亡及 bcl2 和 bax 基因表达的影响，并探讨其肾保护的机制. 方法： 18 只雄性 SD 大鼠随机分为 3 组: 假手术组（S 组） ，缺血再灌注组（I/R 组） ，缺血后处理组（IPo 组）,每组 6 只. 采用夹闭双侧肾蒂 45 min, 再灌注 6 h 制备肾脏缺血再灌注模型. IPo 组在夹闭双侧肾蒂 45 min 后，再灌注 10 s，缺血 10 s，反复 3 次，再全面恢复血液灌注. 再灌注 6 h 时处
2、死大鼠， 酶法测定血清肌酐（Cr）含量;苦味酸不除蛋白法测定尿素氮（BUN）含量;采用逆转录多聚酶链反应（RTPCR ）检测肾组织 bcl2 mRNA 和 bax mRNA 表达，表达水平以与其相应的内参 actin 的光密度比表示；原位末端脱氧核苷酸转移酶标记（TUNEL）法检测肾组织中凋亡细胞，计算细胞凋亡指数（AI） ；苏木素 伊红（HE） 染色，在光镜下观察肾组织病理学变化. 结果：与 S组比较，I/R 组肾组织 Cr 和 BUN 浓度升高（P0.05） ，bcl2 mRNA表达量降低（P0.05） ，bax mRNA 表达量升高（P0.05） ，bcl2 mRNA/bax mRNA
3、的比值降低（P0.05） ，AI 增加（P0.05） ，组织形态学观察可见肾小管上皮细胞水肿，变性坏死，肾小管扩张，间质淤血、水肿、大量中性粒细胞浸润. 与 I/R 组相比， IPo 组肾组织 Cr 和BUN 浓度降低（P0.05） ，bcl2 mRNA 表达量升高（P0.05） ，bax mRNA 表达量降低（P0.05） ，bcl2 mRNA/bax mRNA 的比值升高（P0.05） ，AI 减少（P0.05） ，肾组织形态学损伤减轻. 结论：缺血后处理可减轻肾脏 I/R 损伤，其肾保护作用可能与其上调 bcl2 基因和下调 bax 基因表达，使 bcl2 mRNA/bax mRNA 比
4、值升高，从而抑制缺血再灌注损伤后的肾组织细胞凋亡有关. 【关键词】 肾 再灌注损伤 细胞凋亡 基因 bcl2 缺血后处理 0 引言 缺血后处理（ischemic postconditioning，IPo）可减轻心肌缺血再灌注(ischemiareperfusion, I/R)损伤1-2 ，还可减轻脑3 、肝4及肠的 I/R 损伤. 本课题的前期研究发现 IPo 可以抑制肾 I/R 损伤诱发的肾组织细胞凋亡，具有一定的肾保护作用，但是抑制凋亡的的具体机制有待探讨. 细胞凋亡是基因控制的细胞主动死亡过程，目前认为至少有两类基因与凋亡调控有关，以 bcl2 为代表的抗凋亡基因和以bax 为代表的促凋
5、亡基因共同调节细胞凋亡. 本研究观察了 IPo 对大鼠肾I/R 损伤后肾组织细胞凋亡及 bcl2 和 bax 基因表达的影响，并探讨IPo 的肾保护机制. 1 材料和方法 1.1 材料 健康雄性 SD 大鼠 18 只，体质量 250280 g，由河北省实验动物中心提供，随机分为 3 组：假手术组（S 组） ，缺血再灌注组（I/R 组） ，缺血后处理组（IPo 组） ，每组 6 只. 术前禁食 12 h，自由饮水. 大鼠腹腔注射 100 g/L 水合氯醛 300 mg/kg 麻醉后，将大鼠仰卧位四肢固定于鼠台上，行腹正中切口，钝性分离肾包膜，显露和游离肾脏，仔细分离肾蒂，保护输尿管，用无损伤动脉
6、夹夹闭双侧肾蒂，肾脏颜色变为暗红色即可确认肾脏血流阻断，造成双侧肾缺血 45 min 后，显露肾脏，松开动脉夹,肾脏由暗红色恢复鲜红色即可确认血流恢复，逐层缝合腹部正中切口. 再灌注 6 h 即为肾缺血再灌注模型. 夹闭和放开肾蒂时腹腔内各注射林格液 20 mL/kg. S 组仅行开腹，游离出双侧肾脏，分离双侧肾蒂不夹闭，伤口用生理盐水纱布覆盖，暴露 45 min 不作肾缺血处理；IPo 组夹闭双侧肾蒂 45 min 后，再灌注 10 s，缺血 10 s，反复 3 次，再全面恢复血液灌注 6 h. 1.2 方法 1.2.1 标本制备 再灌注后 6 h,过量麻醉剂下经心脏抽血迅速处死动物. 将血
7、液标本注入离心管，静置 30 min， 2500 r/ min 离心 15 min,提取血清标本，-70冰箱保存待测. 在无菌条件下，迅速摘取左肾，分装入 1.5 mL 离心管，液氮冻存，用于进行 PTPCR. 取右肾，40 g/L 多聚甲醛固定，制备石蜡切片，4保存待用. 1.2.2 血清 Cr, BUN 含量的测定 应用 SelectraE 全自动生化分析仪（Vital，荷兰）酶法测定血清 Cr 水平，苦味酸不除蛋白法测定 BUN含量. 1.2.3 肾组织 bcl2 mRNA 和 bax mRNA 表达的测定 取 50100 mg 标本匀浆后，Trizol 试剂提取总 RNA，琼脂糖凝胶电
8、泳鉴定 RNA 完整性，紫外分光光度计检测法测定 RNA 含量，取等量 RNA 逆转录合成cDNA，以 actin 为内参照，扩增 bcl2, bax 和 actin ，所有引物均由上海生物工程公司合成. 引物序列和扩增产物长度（表 1）. bcl2 基因扩增条件为：94变性 5 min，然后 94 45 s，52 30 s，72 45 s，35 个循环，最后 72延伸 5 min. bax 基因扩增条件为：94变性 5 min，然后 94 45 s，56 45 s，72 45 s，35 个循环，72延伸 5 min. 取 RTPCR 产物 4 L，加上样缓冲液 1 L，在 15 g/L 琼脂
9、糖凝胶上电泳，用凝胶图像分析系统（GelPro Analyzer Version 3.0）进行光密度测量，以目的基因与内参 actin 的比值代表该样品 PCR 产物的相对含量. 表 1 RTPCR 检测 bcl2, bax 和actin 基因表达的引物序列和扩增产物长度 1.2.4 肾组织病理学观察和凋亡细胞的检测 HE 染色，光镜下观察肾组织病理学改变. TUNEL 法测定肾组织中凋亡细胞（试剂盒购自德国Boehringer Mannhiem 公司） ，细胞核呈棕黄色者为阳性细胞,随机选取 5个视野,光镜下计数凋亡细胞，以肾小管上皮凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管细胞凋亡指
10、数（apoptotic index，AI） ，AI(%)=阳性细胞数/视野所有细胞总数100%. 统计学处理：采用 SPSS 11.5 软件进行统计学分析，计量资料以xs 表示，组间比较采用单因素方差分析, P0.05 为差异有统计学意义. 2 结果 2.1 各组 Cr, BUN 水平的变化 再灌注 6 h 时，与 S 组相比， I/R组和 IPo 组 Cr, BUN 水平均明显升高（P0.05） ，与 I/R 组比较，再灌注 6 h 时，IPo 组 Cr, BUN 浓度降低（P0.05,表 2）. 2.2 bcl2 mRNA, bax mRNA 及其比值的变化 PCR 所得的bcl2 ，ba
11、x 和 actin 条带的大小与预期一致（扩增目的片段长度bcl2 为 702 bp，bax 为 407 bp，actin 为 375 bp） （图 1）. bcl2 mRNA 电泳条带 S 组最明显，IPo 组比较明亮，I/R 组较浅. bax mRNA 电泳条带 S 组浅暗，IPo 组比较明亮，I/R 组最明显. 与 S 组相比，I/R 组和 IPo 组 bcl2 mRNA 表达量降表 2 三组大鼠肾 I/R 损伤 6 h 时肾功能的比较表 3 三组大鼠肾组织 bcl2 mRNA, bax mRNA 及其比值和凋亡指数的比较 aP0.05 vs S 组; cP0.05 vs I/R 组.
12、S 组：假手术组；I/R 组：缺血再灌注组；IPo 组：缺血后处理组. 2.3 组织病理学结果 S 组肾小球、肾小管未发现明显的形态学改变（图 2A） ；I/R 组部分肾小管上皮细胞肿胀，出现水样变性和空泡变性，肾小管扩张，内可见管型和坏死脱落细胞，少量肾小管腔内有蛋白性液体积聚，间质充血水肿，大量炎细胞浸润，管周血管明显扩张淤血（图 2B） ；IPo 组肾小球轻度淤血，少量肾小管上皮细胞轻度水肿、空泡变性，罕见管型，间质充血水肿，有少量炎细胞浸润管周稍有淤血（图2C）. 2.4 肾小管上皮细胞凋亡的变化 S 组偶见凋亡细胞， I/R 组和IPo 组凋亡细胞数增加（图 3）. 与 S 组相比，
13、 再灌注 6 h 时， I/R 组和 IPo 组 AI 明显增高（P0.05） ； 但 IPo 组 AI 较 I/R 组下降（P0.05, 表 3）. 3 讨论 本研究中 I/R 组 Cr 和 BUN 浓度水平明显升高，提示肾功能严重受损，肾组织形态学损伤严重，说明肾脏缺血再灌注损伤模型成功建立5. 本实验所采用的后处理的时间和次数是根据预实验结果和参考文献6-7确定的. 有研究表明，肾 I/R 损伤与肾组织细胞凋亡及其调控基因 bcl2 和bax 的表达密切相关8-9. bcl2 可通过抑制自由基的产生及细胞内钙超载、抑制线粒体膜的通透性、阻止细胞色素 C 的释放及 caspase 的激活等
14、机制发挥抑制凋亡的作用. 最近有研究发现 bcl2 蛋白能通过降低氧自由基活性和抑制氧自由基生成发挥抗氧化作用，还能维持线粒体的氧化功能10. bax 是促凋亡基因，能促进细胞因子缺失而诱导细胞凋亡，bcl2 与 bax 可形成二聚体，两者的比例决定细胞向存活还是凋亡方向发展. 本研究证明 IPo 可能通过上调肾小管上皮细胞 bcl2 和下调 bax，从而使 bcl2/bax 比值升高来发挥其抗氧化、增加膜稳定性作用. 本实验所采用的缺血再灌注前、反复短暂的预再灌注、停灌注的 IPo方案，在某种意义上相当于有控制的缓慢间歇性复氧，可减少突然复氧时氧自由基的爆发性产生，并刺激胞内抗氧化酶和自由基
15、清除剂的释放而发挥保护效应. IPo 发生在缺血后、再灌注前，是从建立一种更合理、更有效的再灌注角度出发, 处理和挽救已缺血肾小管上皮细胞，最大限度地减轻再灌注损伤. 而且 IPo 是在器官缺血后、恢复全面血流灌注前施之，方法简单、时间从容，因此可能更有直接的临床实用价值11. 综上所述，IPo 可减轻肾脏 I/R 损伤，其肾保护作用可能与其上调bcl2 基因和下调 bax 基因的表达，使 bcl2 mRNA/bax mRNA 比值升高，从而抑制缺血再灌注损伤后的肾组织细胞凋亡有关. 【参考文献】 1 Sato H, Jordan JE, Zhao ZQ, et al. Gradual rep
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