1、人类自然杀伤细胞发育研究进展【关键词】 自然杀伤细胞; 发育; 分化; 定向自然杀伤（natural killer, NK）细胞是淋巴细胞的一种亚型, 能够参与机体的固有免疫和适应免疫。人类 NK细胞是淋巴细胞循环中的一个重要部分, 约占淋巴细胞的 20%, 在脾脏和骨髓占 5%10%, 在其他未发生感染的淋巴器官只有很小的比例（小于 1%） 。免疫反应早期, NK细胞通过直接溶解靶细胞的方式或通过释放细胞因子募集其他类型白细胞的方式杀伤感染病毒的细胞或发生肿瘤性转化的细胞, 细胞毒性 T细胞（cytotoxicity T lymphocyte, CTL）与 NK细胞有着相似的功能, 也参与以
2、上免疫反应。近 20年, T细胞和 B细胞的发育过程研究得比较清楚, 但对 NK细胞发育的认识仍旧比较局限。近几年, NK细胞发育的研究取得较大进展, 基本阐明了 NK细胞的发育部位、 发育阶段以及发育过程中免疫表型的变化。1 NK 细胞的发育部位1.1 骨髓的 NK细胞发育 NK细胞可以在多个部位发育。胚胎时期, 在骨髓、 肝脏、 胸腺、 脾脏、 淋巴结和肠道均发现 NK祖细胞（NK progenitor, NKP） 1 。胎肝内的 CD34+CD38+细胞群中包含 NK祖细胞, 此细胞只能发育成 NK细胞。胎儿胸腺内的 CD34-CD5-CD56-细胞群也具有发育成 NK细胞的能力, 同时
3、可以发育为 T细胞, 被称为具有双向分化潜能的 T/NK前体细胞2 。早期研究已经证实破坏骨髓的微环境能够导致严重的 NK细胞缺乏和功能缺失, 因此认为骨髓是 NK细胞发育的重要场所。目前, 多数学者认为 NKP来源于骨髓, 其免疫表型是CD34+CD56-, 可受干细胞生长因子（stem cell growth factor, SCF） 、 kit配体和 flt3 配体刺激进一步分化为 CD34dimCD45RA+Integrin7+细胞, 迁移至二级淋巴样组织后在 IL2 和 IL15 的刺激下分化成熟为NK细胞3, 4 。研究表明5, NKP生成、 获得特异 NK细胞表面标记和部分功能的
4、获得等发育过程均可在骨髓中完成。1.2 胸腺 NK细胞发育 小鼠体内实验证实5, 6来源于胸腺的 NK细胞高表达 CD127（IL7 受体 链）, 其发育依赖于转录因子GATA3的调节。研究表明6, 人类胸腺内同样存在 CD127阳性的 NK细胞。此外, 人类外周血中 CD56brightCD16-的 NK细胞表达 CD127和GATA3, 而 CD56dimCD16+的 NK细胞不表达 CD127和 GATA3。因此, 推测不同 NK细胞亚型可能来自于不同的发育部位。1.3 淋巴结和扁桃体 NK细胞发育 可能是淋巴结和扁桃体只有不足 1%NK细胞的缘故, 这两个器官的 NK细胞发育长期以来被
5、免疫学家忽视。Freud 和他的同事研究证实7, 8淋巴结和扁桃体中的CD34+CD45RA+Integrin7+细胞在体外培养时能够发育为CD56brightCD16dim/-的 NK细胞。他们根据 NK细胞在扁桃体、 淋巴结发育过程中的免疫表型变化将此过程分为 5个阶段: 祖细胞阶段、 前体细胞阶段、 不成熟阶段、 CD56brightCD16dim/-阶段和CD56dimCD16bright阶段（图 1） 。相关研究证实淋巴结和扁桃体内的 NKP细胞来自于骨髓9 。图 1 人类 NK细胞发育各阶段免疫表型变化模式图（略）2 NK 细胞的发育阶段2.1 NK细胞定向分化 NKP来源于造血干
6、细胞（haematopoietic stem cell, HSC）或淋巴样祖细胞(common lymphoid progenitor, CLP)3 。骨髓中 CLP的免疫表型为 CD34+CD38-CD7+, 可以分化为 T细胞、 B细胞和 NK细胞10, 11 。CD38 是淋巴造血系统中 HSC和 CLP发生进一步分化的标志性分子, 其阴性提示尚未发生定向分化, 而 CD38阳性表达则提示已经发生定向分化, 部分研究证实 CD34+CD38+CD7+表型的细胞为 NKP3 。所谓 NKP是指该细胞有发育为成熟 NK细胞的能力, 但是不会发育成其它淋巴细胞系。然而, 由于 NK细胞、 T细
7、胞和树突状细胞（dendritic cell, DC）分化早期阶段的分化路径十分相似, 祖细胞在特殊环境或细胞因子的诱导下可能会偏离正常分化轨道, 尤其是 T细胞与 NK细胞。20 世纪 90年代初期部分学者提出 T/NK前体细胞的假说12, 认为此前体细胞可以分别分化为 T细胞或 NK细胞。Sanchez 等2通过对胸腺 CD3-CD4-CD8-CD34+细胞的培养, 得到成熟的 NK细胞和T细胞; 针对胸腺 CD3-CD4-CD8-CD5-CD56+细胞进行培养, 只能得到成熟的 NK细胞, 而培养 CD56-CD5-细胞既能够得到成熟的 NK细胞又能得到 T细胞, 从而证实 CD56+细
8、胞出现于 NK祖细胞之后, 并认为存在 T/NK前体细胞。研究表明13, T/NK前体细胞在不同的微环境或者被不同的细胞因子诱导可以转向不同的分化方向。Freud 等8的研究证实 NK细胞在发育的前体阶段仍可被诱导而向 T细胞方向分化, 只有进入不成熟阶段时才不能分化为 T细胞。因此, 可能从 CLP至 NK前体阶段的这一较长的发育空间都属于 T/NK前体细胞。2.2 NK祖细胞和前体细胞阶段 研究表明, 人类的 NKP包含在CD34+CD38+CD45RA+细胞群7, 此细胞群中的 CD7+CD10-细胞则更为准确地定向于 NK细胞9 。CD25 是 IL2 受体 , 可以与 IL2 特异地
9、结合, NK祖细胞阶段和 NK前体细胞阶段均表达 CD25说明 NK细胞的发育需要 IL2 的刺激。CD117 又称为 ckit, 是淋巴造血系统早期细胞发育过程中表达的重要标记, 与 ckit 配体结合后可促进细胞发育, 部分NKP和前体 NK细胞表达 CD117。NKP 向下游分化为 NK前体细胞, 此时弱表达 CD34抗原, CD16和 CD94等成熟的 NK细胞标记均未表达, 但可出现小比例的 CD56+细胞。研究表明8, 14, NK前体细胞群中存在CD117+CD44+细胞, 该免疫表型的细胞同样存在于 T前体细胞（图 1） 。2.3 不成熟的 NK 细胞 此阶段的 NK细胞开始表
10、达粒酶 B、 穿孔素和 TIA1 等细胞毒性颗粒, 但表达量很少, 缺乏杀伤能力8 。研究表明15, 体外培养脐带血的 CD34+Lin-细胞可分化为 CD56-CD161+细胞群, 该群细胞缺乏细胞毒性和 KIR家族受体, 属于不成熟的 NK细胞。继续培养时可以分化为 CD56+CD161+细胞群。进一步研究表明3, 8, 此阶段 NK细胞有 CD122的表达, 可被 IL15 刺激发生进一步分化（图1） 。CD122 是 IL2 受体 , 可以与 IL2 和 IL15 结合, 该抗原标记只表达于 NK细胞, 是区别 NK细胞与 T细胞分化的一个重要标记。2.4 成熟 NK细胞 人类成熟的
11、NK细胞有两种类型16 （图 1）: 一种是高表达 CD56、 低表达或不表达 CD16（CD56brightCD16dim/-）, 占外周血 NK细胞的 10%; 另一种是低表达 CD56并高表达CD16（CD56dimCD16bright）, 占外周血 NK细胞的 90%。这两种 NK细胞的分布与功能有明显的不同, 其中 CD56brightCD16dim/-细胞具有较低的细胞溶解能力和较强的细胞因子合成能力; CD56dimCD16bright则相反, 有丰富的胞内穿孔素和较强的细胞毒性。这两种成熟的 NK细胞是不是由同一种前体细胞产生或有独自的发育途径, 目前仍不清楚。体外实验表明17
12、, 细胞因子刺激 CD56dimCD16bright细胞可以下调 CD16表达, 上调 CD56表达。Huntington 等3从三个方面阐明CD56brightCD16dim/-细胞是 CD56dimCD16bright细胞的前体细胞: 其一, 骨髓移植后短期内病人外周血中 CD56bright细胞比例明显增加, 之后会出现下降, 而此时 CD16bright细胞比例明显增加 ; 其二, 通常端粒酶的长度是随着细胞分裂和老化而缩短, 来源于同一个体的CD56dimCD16bright细胞的端粒酶明显比 CD56brightCD16dim/-细胞的端粒酶短; 其三, 将 CD56brightC
13、D16dim/-细胞移植入 NOD/SCID小鼠后, 能够分化为 CD56dimCD16bright细胞群。3 NK 细胞的双向分化特征2006 年, Veinotte 等18在鼠外周血中发现伴有 TCR 受体的 NK细胞亚型, 在胎鼠外周血中占 NK细胞的 5%, 在成年鼠占 1%, 而在裸鼠（无胸腺）无此种 NK细胞。因此, 推断伴有 TCR 受体的 NK细胞来源于胸腺。在人类目前还未见相似的研究报道。成熟阶段的 NK细胞与 T细胞免疫表型有一定的交叉。正常的 NK细胞中有一小部分细胞表达 CD8分子, 但无 TCR受体形成 17 。CD3 表达始于 NK细胞或 T细胞的前体期12, 位于
14、 NK细胞的细胞浆, 但在NK细胞通常无 CD3表面抗原的表达。4 NK 细胞发育相关的细胞因子和转录因子CD34+细胞需要多种细胞因子的刺激才能发育成 NK细胞, 包括 SCF、 Flt3L 、 IL7 、 IL2 和 IL15, 其中 IL2 和 IL15 是人类 NK细胞发育重要的细胞因子1 。转录因子在 NK细胞发育过程中亦十分重要, 比如 Id2和 Id3在人类 CD34+细胞过表达阻止其发育为 T细胞、 B细胞或 DC细胞, 而促进其发育为 NK细胞19 。抑制 Id2缺陷小鼠体内的 E47蛋白, 可以补救小鼠的 NK细胞发育。说明 Id2是通过抑制 E47起到促进 NK细胞发育的
15、作用。以上研究说明准确的 NK细胞定向发育需要多种细胞因子和转录因子的参与1 。5 NK 细胞发育在淋巴瘤研究的应用结外鼻型 NK/T细胞淋巴瘤是一种侵袭性的淋巴造血系统肿瘤, 在我国发病率相对较高, 欧美地区少见。该肿瘤表达 NK细胞相关抗原, 偶尔有 T细胞抗原的表达并伴有 T细胞受体基因重排20 。虽然该肿瘤已被认识近 20年, 但是目前仍不清楚其真正的细胞起源（NK 细胞起源或 T细胞起源）和其肿瘤细胞的分化阶段。因此, 正常 NK细胞的发育研究对于明确结外鼻型 NK/T细胞淋巴瘤的分化状态和细胞起源有重要的参考价值。【参考文献】1 Blom B, Spits H. Developme
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