1、日本脑炎病毒糖蛋白模拟短肽的筛选和基因定位作者：任君萍 马文煜 杨乔欣 肖毅 丁天兵 黎志东 【关键词】 脑炎病毒 关键词: 脑炎病毒，日本;抗体，单克隆;噬菌体;肽库;表位 摘 要:目的 寻找 JEV mAb2F2 识别的抗原表位，为 JEV 小分子多肽疫苗合理设计提供依据. 方法 链亲和素包被塑料平皿，加入生物素标记 2F2 与噬菌体随机 15 肽库，再洗脱，扩大培养进行三轮淘筛，经夹心ELISA、竞争 ELISA 鉴定后，挑取 10 个阳性克隆，DNA 测序，与 JEV E 蛋白同源分析. 结果 筛选到的噬菌体能特异地与 2F2 结合，并且这种结合可被天然抗原所抑制.10 个克隆的氨基酸
2、序列相同:-HTPQWSP-SQYRPSLR-，同源分析在 JEV E 蛋白 224229aa 得到一个同源性较高的序列:PXXSPS. 结论 PXXSPS 可能为 JEV E 蛋白的一个模拟表位. Keywords:encephalitis virus，Japanese;antibodies，mono-clonal;bacterio phages;peptide library;epitopes Abstract:AIM To screen the epitope of Japanese encephali-tis virus（JEV）mAb2F2in order to assist in
3、the design of the peptide vaccine against JEV.METHODS The plasmid dish with SV was coated，the biotinylated2F2and15-mer peptide library were added，and the binding phage was eluted and then amplified.After three rounds biopanning，the posi-tive clones were identificated by sandwich ELISA，competi-tion E
4、LISA and DNA sequencing.Amino acid sequences of10positive clones were compared with the JEV E protein.RESULTS Short peptide displayed on phage specifically was bound to2F2and the binding was inhibited by natural JEV Ag.Amino acid sequences of10positive clones were consen-sus:-HTPQWSPSQYRPSLR-.By hom
5、ology analysis，one higher homologous sequences were found in JEV E protein224229aa:PXXSPS.CONCLUSION PXXSPS might be a minotope of JEV E protein. 0 引言 日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的流行性乙型脑炎（乙脑） ，是一种严重的急性中枢神经系统传染病，主要在东南亚等地区流行.采用疫苗进行预防接种是控制该病流行的有效措施.目前国内外使用的乙脑疫苗尚不理想，如出现不良反应和有毒力逆转的可能性，乙脑新型疫苗
6、研制势在必行.但对 JEV 抗原表位认识的不足影响了乙脑新型疫苗的研制.噬菌体表面呈现技术（phage display）和随机肽库技术（random peptide library，RPL）提供了深入研究病毒抗原表位的可能1 .JEV 囊膜糖蛋白 E 是病毒表面主要的结构蛋白与诱导保护性免疫的主要成分2 .本实验用高中和活性抗 JEV E 蛋白的鼠 mAb2F2淘筛噬菌体随机 15 肽库，以期找出这株 mAb 识别的抗原表位，为 JEV 小分子多肽疫苗合理设计提供依据. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 X15（15 肽库） 由 Australia 的 Yip YL 教授惠赠，随机多样
7、性 1.3109 ，测序引物 5-CTGAA-GAGAGTCAAAAGC-3，宿主菌K91kana. 1.1.2 链霉亲和素（SV）和生物素酯（NHS-biotin） 购自 Sigma公司. 1.1.3 HRP-anti M13mAb 为 Pharmacia 产品. 1.1.4 噬菌体单链 DNA 提取试剂盒 为上海华舜公司产品. 1.1.5 抗原 纯化的 JEV 鼠脑抗原（JEV Ag）及正常鼠脑抗原为本室制备3 . 1.2 方法 1.2.1 mAb 的纯化和标记 抗 JEV E 蛋白的鼠 mAb2F2 为本室制备4 ，具有种特异性及高中和活性，IgG2a 类.常规方法制备单抗腹水，辛酸-硫
8、酸铵法提取 IgG，经 DEAE-Sepharose FF 离子交换柱纯化后标记生物素. 1.2.2 淘筛噬菌体随机肽库 SV 包被 35mm 塑料平皿，BSA 封闭后，TBST 振洗 6 次，同时生物素标记 mAb 与肽库 4反应过夜，加入平皿.室温轻摇 10min，TBST 振洗 10 次，加入甘氨酸-盐酸（pH2.2）洗脱液，室温轻摇 10min，收集洗脱液，加 1mol Tris-HCl（pH9.1）中和，测定洗脱物噬菌体滴度，计算投入产出比，扩增噬菌体并测滴度，取一半用于下一轮淘筛5 .按上述方法淘筛三轮，各轮 mAb 用量分别为15g，1.5g，0.2g. 1.2.3 夹心 ELI
9、SA 检测噬菌体 2F2（100mg L-1 ）包被酶标板，BSA 封闭后，加入第三轮淘筛扩增的噬菌体及阴性对照 15 肽库，1010 TU/孔，室温振摇 1h，加 HRP-anti M13mAb，室温振摇 1h，OPD 显色，测A490nm 值.包被时设无关 mAb，分别为 2H4，CHA9，A4，及无关蛋白 BSA和 SV，包被浓度均为 100mg L-1 . 1.2.4 竞争 ELISA 检测噬菌体 2F2（100mg L-1 ）包被酶标板，BSA 封闭，不同浓度 JEV Ag 与第三轮淘筛扩增的噬菌体（1010 TU）混合物加入包被孔内，室温振摇 1h，加 HRP-anti M13mA
10、b，室温振摇1h，OPD 显色，测 A 490nm 值.另外，阴性对照为不同浓度正常鼠脑抗原与第三轮淘筛扩增噬菌体（1010 TU）混合物，阳性对照为第三轮淘筛扩增的噬菌体（1010 TU）. 1.2.5 挑选噬菌体阳性克隆及 DNA 序列测定 第三轮淘筛的洗脱物感染宿主菌，铺平板，随机挑取 20 个克隆，扩大培养并测滴度，用上述夹心 ELISA 方法检测 20 个克隆与 2F2 的结合特性.挑选 10 个阳性克隆，扩增收集上清提取单链 DNA（按试剂盒说明操作） ，自动测序. 1.2.6 同源分析 利用计算机软件 DNA Club，将测序结果与 JEV E蛋白进行同源分析. 2 结果 2.1
11、 淘筛肽库 对三轮淘筛的投入产出比进行了比较（Tab1） ，后两轮的投入产出比均高于前一轮，而第三轮高于第一轮约 100 倍，说明了富集效果良好. 2.2 夹心 ELISA 结果 第三轮筛选到的噬菌体与包被 2F2 反应的A490nm 值高于其与无关 mAb 及无关蛋白反应的 A490nm 值 2 倍以上，而且远大于阴性对照 15 肽库与 2F2 反应的 A490nm 值，另外无关 mAb 与筛选 到的噬菌体及 15 肽库反应的 A490nm 均小于 0.1，说明第三轮筛选到的噬菌体能够特异地与 2F2 结合（Fig1）. 表 1 每一轮淘筛投入产出比 略 图 1 略 2.3 竞争 ELISA
12、 结果 根据 A490nm 值，计算竞争抑制百分率，绘制竞争曲线（Fig2）.竞争抑制百分率=（阳性孔 A 值-被抑制孔 A 值）/阳性孔 A 值100%.从 Fig2 可以看出，正常鼠脑抗原对筛选到的噬菌体与2F2 的结合几乎无竞争抑制作用，而 JEV Ag 对二者的结合有竞争抑制作用，竞争抑制率高达 86%. 图 2 略 2.4 噬菌体阳性克隆测序结果与分析 10 个阳性噬菌体克隆展示外源肽的序列完全一致:-HTPQWSP-SQYRPSLR-.将此氨基酸序列与 JEV E 蛋白序列进行同源性分析，在 E 蛋白 224-229aa 有一个同源性较高的序列PXXSPS（Fig3）. 图 3 略
13、 3 讨论 RPL 技术自 1985 年建立以来，在研究分子间相互识别，如抗原-抗体、配体-受体、酶-底物等诸多领域已显示出独特的优势.蛋白质抗原表位（epitope）分析是研究抗原分子的结构和功能、抗原-抗体反应的识别机制的基础.在医学研究中，可为亚单位疫苗或多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要的线索和依据.用 mAb 淘筛噬菌体随机肽库，已成功地分析了多种蛋白质的抗原表位6 .本实验室的杨乔欣等7 用单纯疱疹病毒型（HSV-）mAb 从噬菌体随机 12 肽库中筛选到的模拟短肽，经鉴定表现出良好的抗原性，可能为 HSV-糖蛋白 gC 的一个模拟表位.白雪帆等8，9 应用
14、 RPL 技术研究汉坦病毒核蛋白抗原表位，确定了与 mAb 反应的最小抗原多肽.本研究中夹心ELISA 和竞争 ELISA 结果说明了经过三轮亲和淘筛得到的噬菌体能够特异地与 mAb2F2 单抗结合，并且这种结合可被天然抗原所抑制，竞争抑制率高达 86%.由此推测筛选到的噬菌体递呈了能与 mAb2F2 决定簇互补区（CDR）相结合的短肽，短肽上可能具有 mAb2F2 识别的表位. 早期利用 RPL 技术所进行的表位研究，主要是分析蛋白质的线性表位.但是新近的研究表明，噬菌体表达的线性多肽也可以模拟大分子抗原空间依赖性表位，引起特异性的强免疫反应，尽管二者的氨基酸顺序可能完全不同，这就是所谓的模
15、拟表位10 .我们淘筛到的噬菌体短肽具有和 mAb2F2 特异结合的功能，但并不和 JEV E 蛋白完全同源，并且以往的研究表明 2F2 很可能是一个抗空间表位的抗体，因此同源分析得到的序列 PXXSPS 可能是 JEV E 蛋白的一个模拟表位. JEV 囊膜糖蛋白 E 具有多种生物学特性，与病毒的致病性和组织亲嗜性密切相关.E 蛋白含有 B 细胞和 T 辅助细胞的表位.Mason 等2 的研究表明，JEV 中和表位大多集中在 E 蛋白空间结构复杂的区域，即短至95 个氨基酸（303396aa）的肽段.Strias-tava 等 11 的研究说明在E 蛋白末端的 1/3 区域存在着线性的表位.
16、而 Seif 等12 的研究进一步定位出在 E 蛋白 373399aa 这一只有 27 个氨基酸的区域存在着线性中和表位.上述研究结果虽然初步定位了 E 蛋白的一些抗原表位，但由于研究技术的限制，均未能准确地测定出表位的大小和组成. 对本实验结果进行深入研究可以从分子水平上加深对 JEV E 蛋白中和表位的认识，从而为 JEV 小 分子多肽疫苗的合理设计提供策略.另外，本实验中 ELISA 结果显示了筛选到的噬菌体短肽具有较好的抗原特异性，为设计以小分子多肽替代 JEV Ag 作为诊断试剂提供了有益的线索. 参考文献: 1Smith GP，Petrenko VA.Phage display J
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