1、全自动（定量 PCR）基因扩增诊断仪配套定量试剂的研制作者：郭晏海 阎小君 孟宪润 崔大祥 侯瑜 韩锋产 冯永强 张菊 赵锦荣 【关键词】 定量 PCR 关键词: 定量 PCR;探针杂交;定量试剂 摘 要:目的 研制一种能用于仪器操作的灵敏、快速、特异的定量试剂. 方法 使用一个生物素标记的上游引物，对 HBV DNA 及其竞争模板 DNA 进行不对称 PCR 扩增，使扩增出的单链带有生物素，并可结合在固定有链亲合素的微孔板的表面.用标有辣根过氧化物酶的待测模板探针和竞争模板探针分别与两个微孔中固定的相应单链 PCR 产物杂交，而后加底物显色，测定吸光度进行分级定量分析. 结果 该定量方法可以
2、检测 10 拷贝数的模板，而且对简便处理的标本适应性强;以分级定量的形式定量时，具有良好的重复性. 结论 该试剂适用于仪器操作，可对临床血清中 HBV DNA 进行分级定量分析. Keywords:quantitative PCR;probe hybridization;quantita-tive kit Abstract:AIM A sensitive，rapid and specific quantitative reagent used in quantitative PCR instrument was researched and the content of HBV DNA in
3、serum was quantified. METHODS The HBV DNA and the competitive DNA tem-plate were asymmetrically amplified by a bio-labeled up-stream primer，the single string PCR products with Biotin were combined to the surface of the streptavidin fixed wells.Then the HRP-labeled sample probe and the competitive pr
4、obe were hybridized with the single-string PCR products fixed in two wells respectively，and then the substrate was added to and Ab values were examined.The result of quanti-tative assay was given by computer.RESULTS 10copy template can be quantified by this kit.The simple preparation of samples DNA
5、is also adapted to this kit and the results can be repeated.CONCLUSION This kit can be used in instru-ment and quantify the content of HBV DNA in serum. 0 引言 用 PCR 技术进行核酸定量分析，有较大的难度.首先，PCR 在扩增过程中，初期扩增产物量与循环数呈指数关系，在扩增后期进入平台期，定量分析应在指数关系区进行.但由于 PCR 扩增效率受多种因素的影响，使得这种定量条件很难控制.二是临床样品中待测核酸含量值跨度很大（可能在 1106
6、拷贝/L） ，对于跨度如此之大的检测对象，要进行准确定量本身就很困难.竞争 PCR 定量方法虽不受扩增平台期现象的影响，但该方法定量的量程窄，要测定临床标本的核酸含量，就需用多个不同浓度的竞争模板分别对同一样品进行多次检测.为了克服竞争 PCR 定量方法的缺点，便于仪器自动检测，我们采用竞争 PCR 产物杂交酶标显色法进行分级定量.这种定量方法克服了以往竞争 PCR 定量的不足，初步实现了半定量核酸分析. 1 材料和方法 1.1 材料 主要仪器与试剂:全自动（定量 PCR）基因扩增仪（本所）;pUC19HBV DNA 质粒为本所克隆.引物与探针:PCR 引物源于 HBV DNA X 基因区1
7、，引物:B1（14021421）5-Bio ATCCT-GCGCGGGACGTCCTT3;B2（16261607）5-CGTTCACGGTGGTCTCCATG3 ，探针位置与序列为（16001580）5HRP-TGCACTTCGCAT-CACGTCTGG3 ，其 5端标记有辣根过氧化物酶（HRP） ，由美国 Maxim Biotech.Inc 制备.血清标本:72 例 HBV DNA 阳性血清，由本校西京医院检验科提供.20 例 HBV DNA 阴性血清，由本校西京医院中心血库提供. 1.2 方法 经典 DNA 提取方法按文献2进行.简便 DNA 提取法:30L 血清加入 30L 处理液（10
8、mmolL-1 Tris-HCl pH8.0，1mmolL-1 EDTA，1mLL-1 NP40）煮沸15min，7000g 离心 5min，吸取上清 5L 作 PCR 模板3 .亲和素包被微孔板按文献4进行.不对称竞争 PCR 扩增3 :PCR 反应体积为30L，其中引物 B1，B2 分别为 50pmol，1pmol.扩增条件为:首先 94预变性 2min，然后 9430s，6040s，7240s 共循环 25 次，取 PCR 产物 10L 进行杂交酶标显色.杂交酶标显色检测5 :准确吸取两份 PCR反应产物各 10L，按 19 分别稀释（稀释液:4.3mmolL-1 Na2 HPO4 ，1
9、.4mmolL-1 K2 HPO4 ;0.5mLL-1 Tween20;40mmolL-1 NaCl，2.7mmolL-1 KCl，pH7.2）于待测微孔和竞争微孔中，混匀后，再分别从中各吸取 10L 溶液，再同样按 19 分别稀释于新的待测微孔和竞争微孔中，混匀后，再同前稀释 1 次，这样待测产物和竞争产物各有 3 个微孔，稀释度分别为 10-1 ，10-2 ，10-3 ，37放置 10min，然后弃去微孔内溶液，用包被液洗 2次，再加入 100L 探针溶液（1molL-1 探针） ，于震荡器上37震摇 20min，用包被液洗微孔 3 次，加入显色底物100L（0.1gL-1 TMB，0.3
10、mLL-1 H2 O2 ） ，37放置10min，加入 0.5molL-1 H2 SO4 终止液 50L 终止显色反应，用全自动（定量 PCR）基因扩增仪测定 450nm 下的吸光度（A）算出定量结果. 2 结果 2.1 定量 PCR 方法的灵敏度 将 pUC19HBV DNA 质粒定量稀释成每管105 拷贝、104 拷贝、103 拷贝、102 拷贝和 10 拷贝用该定量方法进行定量检测，循环程序为 25 次，准确吸取扩增产物 10L 进行 PCR 产物杂交酶标显色，杂交酶标显色法可检测到初始模板量为 10 拷贝（Fig1）. 2.2 杂交酶标显色法的特异性 对 10 份 HBV DNA 阳性
11、和 10 份 HBV DNA 阴性标本进行 PCR 扩增 25 个循环以后取产物进行杂交酶标显色，10份 HBV DNA 阳性标本最终 A 分别为 1.121，3.000， 2.080，2.258，0.646，1.252，1.143，0.389，0.912，0.537，而 10 份HBV DNA 阴性标本 A 分别为0.210，0.217，0.195，0.196，0.184，0.175，0.177，0.188，0.176，0.198，cut off=0.325.阴阳标本被明显区分，说明该方法的特异性强. 图 1 略 2.3 重复性试验 将 pUC19HBV DNA 质粒定量稀释，用该定量方法进
12、行测定，每种浓度的模拟样品各测 10 次，当 Logcopy 为0.5，1.5，2.5，3.5，4.5 和 5.5 时，其 Geomatic 分别为0.480.175，1.460.171，2.510.133，3.520.136，4.480.155和 5.550.172.都在相应的等级内，结果无差异. 2.4 临床标本 HBV DNA 的分级定量测定 用传统的酚/氯仿抽提乙醇沉淀法和简便法分别对临床 72 例 HBV DNA 阳性标本和 20 份 HBV DNA 阴性标本进行处理，PCR 扩增 25 次循环，结果 72 份阳性标本中杂交显色检测对两种处理方法的检出率分别为:100%（72/72）
13、 ，91.7%（66/72） ，20 份 HBV DNA 阴性血清结果都为阴性（Fig2）. 图 2 略 3 讨论 由于酶标显色的线性范围窄（0.33.0A 之间）;同时要用一种浓度竞争模板测定 101 105 拷贝的待测模板，为此我们采用了物理稀释的办法，将 PCR 产物在杂交微孔中连续 3 次 10 倍稀释，即 10 倍，100 倍和1000 倍稀释，用全自动（定量 PCR）基因诊断仪测定落在线性检测范围内的最大稀释倍数的微孔的吸光度，然后根据竞争模板和待测模板产物的吸光度比值，算出定量结果.基本算式为:待测模板初始量=竞争模板初始量待测产物吸光度（A）/竞争产物吸光度（A0 ）.我们采用
14、分级定量的方法来表示测定结果.将定量结果分为 6 级分别为:110 1 拷贝为级;1101 1102 拷贝为级;1102 1103 拷贝为级;1103 1104 拷贝为级;1104 1105 拷贝为级;1105 拷贝为级. 用该方法对 6 种浓度的模拟样品分别进行 10 次测定，可以看出距竞争模板浓度（1103 拷贝）相差越远，标准差越大，级和级的标准差分别为 1100.175 和 1100.172 ;级和级的标准差分别为1100.133 和 1100.136 .虽然如此，它们的误差仍在 1 个数量级以内，不会影响分级定量的结果.对 72 例 HBV DNA 阳性血清和 20 例 HBV DN
15、A 阴性血清分别采用酚/氯仿抽提乙醇沉淀法和简便法进行 HBV DNA 提取，对它们进行分级定量测定，样品的处理方法对分级定量结果影响不大.说明该定量方法能适应临床标本的简便处理方法. 参考文献: 1Ono Y，Onda H，Sasada R，Igarashi K，Sugino Y，Nishioka K.The complete nucleotide sequences of the cloned hepatitis B virus;subtype adr and adw J.Nucleic Acids Res，1983;11（6）:1747-1757. 2Sambrook J，Fritsch
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