1、神经生长因子对新生大鼠 HIBD 后海马区凋亡相关蛋白表达的影响作者：胡伟，巩守平，李文妍，王岗，黄绍平 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of nerve growth factor (NGF) on the expression of apoptosisrelated proteins (Bcl2, Bax)in hippocampus of neonatal rats following hypoxicischemic brain damage (HIBD), and its molecular biological mechanism
2、. METHODS: Seventytwo rats were randomly divided into control group, HIBD group and NGF group. The rat models of HIBD were established by modified RICE method. Immunohistochemistry and TUNEL staining were employed respectively to detect the expressions of Bcl2 and Bax and the number of apoptotic hip
3、pocampal neurons. RESULTS: More or less apoptotic neurons could be observed in hippocampus in HIBD group and the level of Bcl2 expression was elevated slightly, while Bax expression was significantly higher than that in control group. After NGF administration, the number of apoptotic neurons was dec
4、reased (P0.01), Bcl2 expression increased (P0.01) and Bax expression decreased remarkably (P0.01) as compared with HIBD group. CONCLUSION: The administration of NGF may increase Bcl2 expression and decrease Bax expression after HIBD in neonatal rats, thus inhibiting the apoptosis in hippocampus. 【Ke
5、ywords】 nerve growth factor; hypoxiaIschemia, brain; brain injuries; hippocampus; apoptosisrelated protein 【摘要】目的： 应用新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型，观察神经生长因子对海马区细胞凋亡及相关蛋白 Bcl2 和 Bax的影响，探讨其神经保护作用的分子生物学机制. 方法： 72只大鼠随机分为对照组、HIBD 组和 NGF治疗组. 应用改良 RICE法制作大鼠 HIBD模型，TUNEL法检测各组动物海马区细胞凋亡数，免疫组化染色观察 Bcl2, Bax蛋白的表达. 结果： 与假
6、手术组相比，新生大鼠 HIBD后海马区存在不同程度的细胞凋亡，Bcl2 表达轻度升高，Bax 表达明显升高. 与 HIBD组比较，NGF 治疗后，凋亡细胞减少（P0.01） ，Bcl2 蛋白表达升高（P0.01） ，Bax 表达下降（P0.01）. 结论： HIBD后，新生大鼠海马区细胞存在细胞凋亡，NGF 治疗增强 Bcl2 表达，减少损伤基因Bax表达，抑制细胞凋亡，具有脑保护作用. 【关键词】 神经生长因子；缺氧缺血，脑；脑损伤；海马；凋亡相关蛋白 0 引言 缺氧缺血性脑损伤(hypoxicischemic brain damage, HIBD)是由于宫内窘迫、新生儿窒息等引起的新生儿脑
7、部严重损伤，有较高的发病率和死亡率, 也是导致智能落后和脑性瘫痪等儿童伤残的主要原因1. HIBD发病机制复杂，涉及多个环节，而凋亡是后期神经细胞缺失和功能障碍的主要原因. 细胞凋亡持续时间较长，适当的治疗可逆转凋亡的病理过程而改善预后. 本实验应用新生大鼠 HIBD模型，以神经生长因子(nerve growth factor, NGF)进行治疗，观察 NGF对新生大鼠 HIBD后海马区细胞凋亡及相关蛋白 Bcl2 和 Bax的影响，探讨其神经保护的分子生物学机制，以探讨 HIBD更为有效的治疗途径和方法，为临床治疗新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxicischemic encephalopat
8、hy, HIE)提供理论依据. 1 材料和方法 1.1 材料新生 7 d龄 SD大鼠 72只，雌雄不拘，体质量 1116 g，由第四军医大学医学动物实验中心提供. 注射用鼠神经生长因子(NGF 恩经复)（厦门北大之路生物工程公司） ；兔抗大鼠 Bcl2 多克隆抗体，小鼠 Bax mAb，免疫组化染色 SP试剂盒，细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士得生物工程公司）. 1.2 方法 1.2.1 动物模型制备参照文献2制作 HIBD模型：大鼠乙醚麻醉后，游离左颈总动脉并永久结扎，术后水浴箱恢复 1 h，再置于 37自制缺氧舱中，以 3 L/ min速度持续输入含 80 ml/L氧气的氮氧混合气体 2 h，
9、制成 HIBD模型. 1.2.2 动物分组大鼠随机分为 3组： 对照组： 24只（假手术处理，仅游离左颈总动脉，不结扎亦不缺氧） ； HIBD组：24 只，RICE 法制备 HIBD模型后腹腔注射生理盐水，间隔 24 h，连用 7 d； NGF组： 24只，HIBD 模型后即刻以 NGF1000 U/kg腹腔注射，间隔 24 h，连用 7 d. 1.2.3 脑组织病理学测评 HIBD后 6, 24, 72 h和 7 d时间点取脑，参照图谱，取含海马脑组织，行 4 m 连续冠状切片. HE染色，光镜下观察海马区细胞层结构；取与 HE相邻切片，TUNEL 染色，计数海马区凋亡细胞数；每一标本取 2
10、张切片，每张切片取 6个视野 (CA1 区 3个视野，CA3区 3个视野)，取两张切片的均值作为该标本结果，以该组 6例样本均值作为该组实验结果. 免疫组化染色检测海马区神经细胞 bcl2 ，Bax蛋白表达. 结果用 Q550CW型图像信号采集与分析系统进行处理，每张切片在海马区随机取 6个位置相应、不重复的视野(CA1 区 3个视野，CA3区 3个视野)，应用 Qwin软件测量灰度值，取 6个视野均值作为该片灰度值，每样本两张切片均值作为该样本实验结果，再以该组 6例样本的均值作为该组实验结果. 统计学处理： 所有计量数据输入 SPSS11.0统计软件分析处理，结果以 xs表示，多组间比较进
11、行单因素方差分析(ANOVA)，两两比较用Turkey方法，P0.05 为有统计学意义. 2 结果 2.1 海马细胞层结构和海马区凋亡细胞光镜下，对照组海马锥体神经元呈多层分布，细胞排列整齐，形态正常，无神经细胞缺失；HIBD 组缺氧缺血（hypoxicischemic, HI）后 6 h细胞肿胀，细胞排列紊乱，HI后 24 h细胞肿胀明显，出现变性、坏死；HI 后 72 h细胞变性、坏死明显；HI 后 7 d海马区细胞片状坏死，细胞消失，空泡形成. NGF组各时间点病理变化较 HIBD组轻，细胞排列尚规则，仅见斑点状神经元变性、坏死. 光镜下胞核呈棕黄色表现者为 TUNEL染色阳性细胞，即凋
12、亡细胞(表 1). 对照组偶见凋亡细胞，HIBD 组 HI后 6 h开始出现凋亡细胞，持续至 7 d；各时间点 NGF组凋亡细胞数少于 HIBD组（P0.05,图1A,B,C). 表 1大鼠左侧海马区细胞凋亡数目的变化（略） bP0.05 vs 假手术， cP0.05 vs HIBD 组. A: 假手术组; B: HI 后 72 h; C: NGF组 72 h. 图 1海马 CA1区凋亡细胞 Tunel 400（略） 2.2 各组新生鼠海马区 Bcl2,Bax 蛋白表达的变化光镜下Bcl2 ，Bax 蛋白表达以细胞浆呈棕黄色为阳性细胞(图 2A,B,C；图 3 A，B，C). 各时间点海马区
13、Bcl2 ，Bax 蛋白灰度值有一定差异(表 2). A: 假手术组; B: HI 后 24 h; C: NGF组 24 h. 图 2海马 CA3区 Bcl2 表达免疫组化 400（略） 3 讨论 细胞凋亡是控制神经系统生长发育动态平衡的必要手段3. 凋亡调控基因包括 ICD/CED基因, Bcl2 基因, p53基因, Fas/Apo基因及Cmyc 基因等，目前认为 Bcl2 基因家族是与 HIBD中凋亡最密切的调控基因之一. Bcl2 和 Bax分别是抑制和促进细胞凋亡的功能相反的两类蛋白质，都定位于线粒体膜上，在细胞凋亡中发挥重要的调节作用. Bcl2 具有很强的抗凋亡作用4 ，它可以减
14、少线粒体膜的通透性及阻止细胞色素 C的释放，因而可阻止凋亡启动因子从线粒体向胞质的释放，切断了细胞凋亡级联式反应中的关键性环节. 而 Bax作为 Bcl2 基因家族的一员，具有对抗 Bcl2 蛋白抑制凋亡的作用，其过度表达可促进细胞凋亡. 本实验显示，HIBD 后 6 h可见阳性凋亡细胞出现，24 h后明显增多，72 h达高峰. 而 Bcl2 蛋白表达在 HIBD后 6 h出现，24 h达高峰，灰度值最低，后逐渐升高，持续至 7 d. 脑损伤后 6 h可见 Bax蛋白表达，72 h表达最强，此后随时间延长逐渐下降. Bcl2 基因表达主要出现在 HIBD后早期，24 h后 Bcl2 基因表达减
15、弱，Bax 蛋白表达逐渐增强，凋亡细胞逐渐增加，提示 Bcl2 基因表达对 HIBD损伤的脑神经细胞具有保护作用；损伤后 Bax表达高峰时间与凋亡高峰时间分布一致，提示 Bax介导了细胞凋亡. 是何因素激活 Bcl2 基因，又通过什么机制导致激活的基因失活，目前尚未确定. 有研究认为，细胞质存在诱导转录因子，可介导细胞质基因表达来调节细胞的生存5. 在诱导核基因转录的核因子(NF)中 NFkB 倍受重视，有学者用特异性抑制剂抑制后Bcl2 基因表达明显下降，阳性凋亡细胞显著增多，提示 Bcl2 基因的表达是一种细胞自我生存保护的一种机制，而 NFkB 对 Bcl2 基因的激活起重要作用6. A
16、: 假手术组; B: HI 后 72 h; C: NGF组 72 h. 图 3海马 CA1区 Bax蛋白表达免疫组化 400（略） 表 2大鼠左侧海马区 Bcl2 和 Bax表达的灰度值（略） bP0.05 vs 假手术， cP0.05 vs HIBD. 研究表明，外源性 NGF能进入小脑和海马，其机理尚不清楚，有研究者认为在这些脑区中，NGF 通过“旁路”有效地透过血脑屏障7. 而脑损伤后，血脑屏障受损，通透性更高. 我们的实验结果证实，腹腔注射 NGF治疗后，相对于 HIBD组，在损伤的各个时相新生大鼠海马区凋亡细胞数目均明显减少，Bcl2 的表达明显增强，在 24 h达到高峰，Bax表达
17、减弱. 说明 NGF可通过促进 HIBD后抑凋亡基因 Bcl2 的表达，抑制 Bax表达，从而抑制神经细胞凋亡，此与以往的研究结果相符8-9. NGF 抑制 HIBD后神经细胞凋亡可能是多因素的，包括促进 Bcl2 表达、抑制 Bax的表达、抗氧化物酶的活化或增加以及钙稳定等多种方式. 对于 NGF通过何种途径来调节 Bcl2 和 Bax表达的，还有待进一步研究. 基金项目：陕西省 2004年社会发展科技攻关项目（2004K11G9 ） 【参考文献】 1 Mercuri E, Ricci D, Cowan FM, et al. Head growth in infants with hypox
18、icischemic encephalopathy correlation with neonatal magnetic resonance imaging J. Pediatrics, 2000, 106（2 pal）:243-255. 2 Vannucci RC, Vannucci SJ. A model of perinatal hypoxicischemic brain damageJ. Ann N Y Acad Sci, 1997,835:234-249. 3 Nijhawan D, Honarpour N, Wang X. Apoptosis in neuronal develop
19、ment and diseaseJ. Ann Rev Neurosci, 2000,23:73-78. 4 FelderhoffMueser U, Sifringer M, Pesditschek S, et al. Pathways leading to apoptotic neurodegeneration following trauma to the developing rat brainJ. Neurobiol Dis, 2002,11:231-245. 5 Brivanolu AH, Darnell JEJ. Signal transduction and the control
20、 of gene expressionJ. Science, 2002,295:813-818. 6 Albetto CG. Characterization of the moecular events following impairment of NFkB driven transcription in neuronsJ. Mol Brain Res, 2002, 109:179-188. 7 Loy R, Taglialatela G, Angelucci L, et al. Regional CNS uptake of bloodborne nerve growth factor J
21、. Neurosci Res, 1994, 39（3）:339-346. 8 Liu YZ, Chrivia JC, Latchman DS, et al. Nerve growth factor upregulates the transcriptional activity of CBP through activation of the p42/p44(MAPK) cascadeJ. Biol Chem, 1998,273(49):32400-32407. 9 Riccio A, Ahn S, Davenport CM, et al. Mediation by a CREB family transcription factor of NGFdependent survival of sympathetic neurons J. Science, 1999,286(5448): 2358-2361.
