1、生后小鼠肾脏发育过程中型胶原表达的实验研究【摘要】 目的 观察型胶原在生后小鼠肾脏发育过程中的表达规律，探讨型胶原在小鼠肾发育成熟过程中的作用。方法 采用免疫组织化学方法检测生后不同日龄小鼠肾组织中型胶原的表达，用细胞图像分析技术和体视学方法对结果进行分析。结果 型胶原表达于生后各日龄小鼠肾脏肾小体、肾小管和集合管的基膜，且随着肾脏的发育成熟，型胶原表达量逐渐增加。结论 在生后肾发育成熟过程中，型胶原表达于基膜存在的部位，可能对基膜的发育成熟起一定的作用。 【关键词】 型胶原 小鼠 肾脏 发育Abstract: Objective To observe the expression of Co
2、llagen in the developing kidney of neonatal mouse and study its function in renal development. Methods The expression of Collagen in neonatal（N）mouse kidneys was examined by IHC, analyzed in a cell image analytical system and stereological method. Results The expression of Collagen can be seen in th
3、e basement membrane of glomeruli, renal tubules and collecting ducts. By cell image analytical system and stereological method, the expression of Collagen was found increasing gradually. Conclusions The expression of Collagen was mainly seen in the basement membrane during renal development. It may
4、play an important role in the development of basement membrane.Key words: Collagen ; mouse; kidney; development1 引言型胶原与层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、硫酸乙酰肝素和其它大分子交联成网格状结构，共同构成基膜1 。型胶原是构成基膜的主要蛋白，占基膜干重 50，穿透整个基膜2 。它通过受体 integrin（整合素）和非 integrin 类的介导，与细胞之间发生粘附反应，直接或间接的控制细胞活动，如粘附或转移，分化和极化，增殖或凋亡及基因表达等，在基膜的形成和稳定中起非常重要的作用3
5、。国内外学者对型胶原在肾组织中表达的研究显示，在肾脏发生发育过程中型胶原以一种复杂的动态方式表达于基膜4 。本实验应用免疫组织化学方法、细胞图像分析技术和体视学方法对生后小鼠肾发育过程中型胶原的表达及其含量变化进行了系统观察和定量分析，为进一步探讨型胶原在肾脏发育成熟过程中的规律及作用提供基本的实验依据。2 实验材料和方法2.1 实验动物昆明小鼠，体重 2530 g， 雌雄各半，供交配用，由辽宁医学院实验动物中心提供。2.2 主要试剂型胶原多克隆抗体（SANTA 公司提供） 。SABC 试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司提供） 。DAB 显色试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司提供） 。2.3 实验
6、方法2.3.1 动物的培育选用成年健康昆明小鼠，按雌雄比例 11 同窝饲养，采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚 0 天。记录受孕时间，然后将孕鼠分笼饲养，每日早 8 时、晚 5 时观察生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后 0 天。记录出生日期与母鼠同窝饲养。选取生后 1 天、3 天、7 天、14 天、28 天、40 天的仔鼠，每组 4 只。2.3.2 标本制备将生后各龄仔鼠经乙醚麻醉后，于腹后壁取出左肾，用排刀法沿横轴将肾脏切开，入 10中性福尔马林固定 3 h，流水冲洗半小时，常规酒精脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，对各组织块作厚为 5 m
7、的连续切片，供免疫组织化学染色使用。2.3.3 免疫组织化学染色切片常规脱蜡至水，3 H2O2 消除内源性过氧化物酶活性，经 pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液抗原热修复，滴加正常山羊血清封闭液、一抗（1100）过夜后，滴加生物素标记的二抗 37孵育 30 min，滴加SABC37孵育 30 min 后 DAB 显色，苏木素复染核，常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。上述各部均用 PBS 缓冲液冲洗。用 PBS 代替一抗作阴性对照。阳性表达为肾小体、肾小管和集合管的基膜均呈不同程度的棕黄色。2.3.4 免疫组织化学染色图像分析用 CIAS-1000 细胞图像分析系统对生后各日龄小鼠肾脏免疫组织化
8、学染色结果进行图像分析，以灰度值表示型胶原表达量，灰度值越大表示型胶原表达量越少，染色越浅。2.3.5 体视学测量每组动物系统随机选取 5 个组织块，每个组织块连续切片后，等间隔选取 5 张切片，每张切片在油镜下观察（1000） ，按“S”形等间隔选取 5 个视野，采用方格测试系统，交点计数法测算型胶原在阳性表达部位的面密度值。公式为：Sv = 2Ll= 2 Ix / Lc. (Lc =Pc a)，式中 Ix 为阳性表达的部位与测试方格的交点数，Pc 为方格系统落在参照系（整个肾组织）的点数，a 为方格两点间的距离，相当于实际长度的0.1 mm。2.3.6 统计学分析所有数据用s 表示。应用
9、SPSS11.5 统计软件进行单因素方差分析，P0.05 有统计学意义。3 结果3.1 免疫组织化学结果生后小鼠肾脏的发生发育仍在进行，型胶原在肾组织中的表达随着肾脏的发育成熟而增加。型胶原在生后发育各个时期的肾小体、肾小管和集合管的基膜均有表达（图 1，2） 。3.2 免疫组织化学染色图像分析结果从 N1d 到 N40d，型胶原表达的灰度值逐渐降低，每个天数与背景染色相比都有统计学意义（P0.05） ，说明型胶原随着日龄的逐渐增加，在肾脏的表达量逐渐增多（表 1） 。 表 1 生后各日龄小鼠肾组织中型胶原总体表达的灰度值（略）3.3 体视学测量结果在生后小鼠肾脏发育过程中，型胶原在阳性表达部
10、位的面密度值逐渐增多（表 2） ，说明其表达量逐渐增加。表 2 生后小鼠肾组织中型胶原总体表达的面密度值（略）经统计分析，每组间数值均有显著性差异，P0.054 讨论在生后肾脏发育和成熟过程中，随着基膜的发育和成熟，型胶原分别表达于肾小体内皮细胞的基膜、肾小囊基膜、肾小管（近端小管、细段、远端小管）和集合管的基膜中5 ，推测型胶原在肾小体的发育和系膜区的形成中都起一定的作用，它对肾小囊的发育成熟和肾小管及集合管的发育成熟也起重要的作用。本实验观察到在肾组织发育成熟过程中，型胶原表达量明显增多，且分布也较广泛，推测它参与诱导肾脏发育的各个阶段，并在肾小体基膜、肾小管基膜等结构的形成、成熟及其形态
11、和功能的维持等方面起广泛的作用。目前已证实至少有 6 种型胶原 链6 ，具体是哪一个链在何时在哪一个部位表达，还有待于进一步研究证实。肾小体基膜是滤过屏障的组成部分7 ，肾小管的基膜是维持小管重吸收、分泌排泄和交换功能的基础8 。本实验观察到在发育各个时期的肾小体、肾小管、集合管的基膜中都有型胶原的较强的表达，推测它对维持肾小体基膜通透性和肾小管正常的分泌重吸收等方面都发挥重要的作用。 （此文图 1-2 见附页 7） （略）【参考文献】1 宋今丹.医学细胞分子生物学M.人民卫生出版社,2003：63.2 Wtanabe H,Stanada H,Shigetonfi S,et al.Urinar
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