1、神经细胞黏附分子在胶质细胞系源性神经营养因子保护多巴胺能神经元中的作用作者：王红军，刘红梅，王炎强，曹俊平，高殿帅 【关键词】 神经细胞 摘要 :目的 研究神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）在胶质细胞系源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）保护 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）损伤的多巴胺（dopamine，DA）能神经元中的作用。 方法 以原代培养的
2、小鼠腹侧中脑神经细胞作为观察对象，实验分 4 组:空白对照组、MPTP 组（在无血清培养基内加入 10mol.L MPTP） 、GDNF+MPTP 组（在无血清培养基内加入 GDNF 保护的基础上，再加入 MPTP） 、抗-NCAM+GDNF+MPTP 组（在无血清培养基内加入 NCAM 封闭抗体阻断 GDNF 保护作用的基础上，再加入 MPTP） 。采用免疫细胞化学染色技术，观察各组酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH） 、钙结合蛋白 D28K（calbindin D28K，CB）表达的变化。 结果 MPTP 组 TH 阳性神经元胞体明显小于空白对照组;CB 阳性神经
3、元数目减少，有统计学意义。GDNF+MPTP 组 TH 阳性神经元胞体与 MPTP 组有明显差别;CB 阳性神经元数目与 MPTP 组有显著性差异。抗-NCAM+GDNF+MPTP 组上述指标与 MPTP 组无显著性差异。 结论 NCAM 参与了 GDNF 保护 DA 能神经元的作用，该保护作用可能是通过增加 CB 的表达而完成的。 关键词 :多巴胺能神经元;胶质细胞系源性神经营养因子;1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶;钙结合蛋白 D28K;神经细胞黏附分子 Abstract:Objective To explore the possible role of neural cell
4、 adhesion molecule（NCAM）in mediating the protective effect of glial cell line-derived neurotrophic actor（GDNF）on dopaminergic（DA）neurons in the mesencephlic cell culture in-jured by1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine（MPTP）.Methods Primary culture of ventral mesencephalic neurons was establi
5、shed.The neurons were studied in four groups:normal control group，MPTP control group，MPTP plus GD-NF test group，and anti-NCAM plus MPTP and GDNF test group.On the8th day，TH and CB immunohistochemistry was per-formed.The morphologic indexes were measured and statistic analysed.Results The long diamet
6、er of TH positive neurons in the MPTP control group was significantly shorter than that in the normal control group.The density of CB positive neurons was al-so decreased in the MPTP injury control group.GDNF could protect the DA neurons against the injury of MPTP.However，the protective effect of GD
7、NF on DA neurons was canceled，when the NCAM pathway was blocked by adding anti-NCAM in the fourth group of the present experiment.Conclusion NCAM can mediate the protective effect of GDNF on DA neurons，and this role may be related to the increase of CB expression. Key words:dopaminergic neurons;glid
8、al cell line-derived neurotrophic factor;1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tet-rahydropyridine;calbindin;neural cell adhesion molecule 中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元参与控制自主运动，它们的变性坏死是帕金森病（Parkin-son disease，PD）的主要病理特征1 。如何保护这些容易受到损伤而变性死亡的 DA 能神经元成为 PD 治疗研究的热点之一。 胶质细胞系源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic f
9、actor，GDNF）于 1993 年由 Lin 等人首次分离纯化胶质细胞系，其对多巴胺能神经元的保护作用已为众多学者所证实24 ，但其保护作用机制如何，目前尚不明确。 介导 GDNF 信号转导的通路有 Ret 依赖性和 Ret 非依赖性两大类5 ，最新研究表明在 Ret 非依赖性信号通路中，神经细胞黏附分子（neural cell adhe-sion molecule，NCAM）可能发挥了重要作用6 。NCAM 是一种广泛存在于神经细胞膜上的黏附分子，若能与 GDNF 结合并起作用，将为探讨 GDNF 的作用机制提供重要依据。Kolkova 等7 发现 GDNF 可通过 NCAM 活化下游的
10、 Fyn、FAK，促进突起的生长。但 NCAM 信号通路是否能影响 GDNF 对 DA 能神经元的保护作用还不明确。另有研究表明，含 CB 的 DA 能神经元具有较强的抗变性能力，那么 NCAM 是否能够影响 CB 的表达，从而在 GDNF 保护多巴胺能神经元中发挥了作用?本实验以小鼠腹侧中脑神经元原代培养为模型，通过阻断 NCAM 的作用，结合TH、CB 免疫细胞化学技术，观察 GDNF 对中脑 DA 能神经元的作用，探讨NCAM 在 GDNF 保护 MPTP 损伤的 DA 能神经元中的作用，为临床治疗 PD 提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 试剂 人重组 GDNF，Sigma 公司;
11、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP） ，Sigma 公司;Anti-NCAM，Sigma 公司;Neurobasal medium，Gibco 公司;B27，Gibco 公司;胎牛血清（FBS） ，Hyclone 公司;小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体（一抗） ，Sigma 公司;小鼠抗大鼠钙结合蛋白 D28K（calbindin D28K，CB）抗体（一抗） ，Sigma 公司。 1.2 中脑神经细胞培养 取胚胎 17.5 天（E17.5）昆明小鼠全脑，置于冰盒上，体视显微镜下分离腹侧中脑，用 DMEM 漂洗 3 遍，剪碎后，加
12、入 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 消化，37水浴 15min。用含 10%胎牛血清的 DMEM 终止消化，巴斯德吸管轻柔吹打 15 下，400 目滤网过滤，1000r.min 离心 5min，弃上清，用含 10%FBS+1%B27 的 DMEM.F12 重悬，以 2105 密度接种于预先铺被多聚赖氨酸的 24 孔培养板内，置 37、5%CO2 、平衡湿度的标准培养箱内培养。24h 后更换为无血清培养基（Neurobasal TM medium，含 2%B27，4mmol.L 谷氨酰胺） ，隔 2 天半量换液。 培养的第 2 天，将细胞分为 4 组:空白对照组、MPTP 组、MPTP+
13、GDNF组、NCAM 通路阻断组（加抗-NCAM，30min 后加 GDNF） 。即于第 28 天加入 GDNF，阻断剂在加 GDNF 前 30min 加入，MPTP 在第 3 天加入，48h 后（第 5 天）换为不含 MPTP 的无血清培养基。第 8 天，行 TH、CB 免疫组织化学。各处理因子及试剂使用的终浓度如下:GDNF 为 20g.L;抗-NCAM为 20mg.L;MPTP 为 10mol.L。抗-NCAM 为 NCAM 的封闭性抗体，可以特异性封闭 NCAM 的胞外区，从而阻断由 NCAM 介导的信号传递。 1.3 TH、CB 免疫组织化学 将细胞用 4%多聚甲醛固定，室温15mi
14、n，3%H 2 O 2 封闭内源性过氧化物酶，室温 10min，10%封闭用羊血清，含 0.03%Triton X-100，37，1h，鼠抗 TH 抗体（一抗） ，11000，鼠抗 CB 抗体（一抗） ，11000，抗体稀释液稀释，4过夜，37复温 1h;对照滴加 0.01mol.LPBS 代替一抗，生物素结合的羊抗小鼠IgG，150，37，2h，辣根过氧化物酶标记的生物素卵白素复合物，37，1h，DAB 室温下反应 12min。倒置显微镜下观察，拍照。 1.4 结果分析 利用光学显微镜，在低倍到高倍等不同的倍数下观察各组 TH 阳性细胞形态。每孔细胞取 6 个视野，计数阳性细胞数，用计算机辅
15、助图像分析系统对各组的 CB 表达阳性细胞进行定量分析。 1.5 统计学处理 使用单因素方差分析程序，分别对均数两两间进行比较和显著性检验，P0.05 有显著性差异。 2 结果 2.1 TH 免疫细胞化学染色结果 TH 为 DA 能神经元特异性的标志酶，本实验以光学显微镜下 TH 阳性神经元的形态为指标评价 NCAM 在 GDNF 保护 DA 能神经元中的作用。空白对照组 TH 阳性神经元胞体大，胞质染色，核仁清晰，突起多而且长，呈树枝状，表现为健康神经元的形态。MPTP组为在无血清培养基内培养 3 天后，加入 10mol.L MPTP，作用 48h 后，换不含 MPTP 的新鲜培养基，继续培
16、养 48h，TH 阳性神经元的形态发生了明显改变，与对照组相比，其胞体缩小，突起数目变少、长度变短，显示细胞受损。加 MPTP24h 前给予 20g.L GDNF，TH 阳性神经元胞体与对照组相差不大，突起数目也多，与 MPTP 组相比，则有明显改善。抗-NCAM+MPTP+GDNF 组，即加 GDNF 前 30min，给予 20mg.L 抗-NCAM，TH 阳性神经元胞体与对照组无明显差异，但突起显著减少;与 MPTP 组无明显区别。见图 1。 图 1 不同实验组 TH 阳性神经元形态的比较（略） A:对照组;B:MPTP 组;C:GDNF+MPTP 组;D:抗-NCAM+GDNF+MPTP
17、 组（DAB法，bar:40m） 2.2 CB 免疫细胞化学染色结果 CB 是细胞内 Ca 2+ 的缓冲蛋白，可以降低 Ca 2+ 介导的细胞毒性作用。本实验通过观察 CB 表达的变化，评价 NCAM 在 GDNF 保护 DA 能神经元中的作用。以单位面积内阳性细胞数为指标进行比较。在培养第 3 天加入 10mol.L MPTP，作用 48h 后，换不含 MPTP 的新鲜培养基，继续培养 48h，CB 阳性神经元数目（1.6670.211）与对照组（4.6670.494）相比明显减少，有统计学意义。在加 MPTP24h 前，给予 20g.L GDNF 作为保护组，可使 CB 阳性神经元数目相应
18、增加，与 MPTP 损伤组有统计学意义。阻断组为在加 GDNF前 30min，给予 20mg.L 抗-NCAM，24h 后再给予 MPTP，CB 阳性神经元数目少于对照组，但与 MPTP 组无显著性差异。见图 2，3。 图 2 不同实验组 CB 的表达情况（略） A:对照组;B:MPTP 组;C:GDNF+MPTP 组;D:抗-NCAM+GDNF+MPTP 组（DAB法，bar:40m） 图 3 不同实验组 CB 的表达情况（略） 3 讨论 近几年，有 2 类治疗 PD 的方法极具前景，一类是通过移植 DA 能神经元直接替代死亡的或受损的神经元，另一类是利用神经营养因子阻止神经元死亡。目前，已
19、发现多种神经营养因子能够促进中脑黑质致密部DA 能神经元存活或阻止其变性，其中，GDNF 是这些神经元最有效的存活因子之一。本实验也证实了这一点，当用 MPTP 损伤 DA 能神经元后 TH 阳性神经元形态发生很大改变，突起明显减少、缩短。加入 GDNF 后，损伤得到改善。 虽然 GDNF 对中脑黑质 DA 能神经元的促存活作用已经很明确，但是其具体的作用机制如何，目前还不清楚;而明确这一点，对于我们更好地利用这一因子至关重要。 介导 GDNF 信号转导的受体系统包括 c-ret 原癌基因编码的信号受体和 GPI-锚定的结合受体，GDNF 可通过 Ret 进行信号传递，该通路为 Ret依赖性的
20、。在一些没有 Ret 的组织里，GDNF 也可以发挥生物学效应，即为 Ret 非依赖性的，据研究，NCAM 在其中发挥了重要作用。NCAM 是神经系统内主要的细胞黏附分子，由于其具有黏附性及传递信号的能力，因而它参与了包括细胞迁移、突起生长及突触的可塑性等许多发育过程。Paratcha 等于 2003 年提出 NCAM 是 GDNF 家族的另一个信号受体，GDNF可以通过 NCAM，进而活化胞内的 Fyn、FAK，促进神经细胞突起的生长。本实验特异性阻断 NCAM 后，发现 GDNF 不能有效保护 MPTP 损伤的 DA 神经元，说明 NCAM 参与了 GDNF 对 DA 能神经元的保护作用。
21、 另外，近年来钙代谢及其体内平衡与老化及神经变性疾病之间联系的研究格外引人注目。有研究表明，含钙结合蛋白的 DA 神经元具有较强的抗变性能力。在本实验条件下发现，MPTP 可使培养的中脑神经元内 CB表达减少，而同时加入 MPTP 和 GD-NF 后，CB 表达增加，说明 GDNF 可以通过促进神经元内 CB 的表达，缓冲细胞内 Ca 2+ 浓度，降低 Ca 2+ 介导的细胞毒作用。而阻断 NCAM 这一 Ret 非依赖性通路后，也阻断了 GDNF使 CB 增加的作用，提示 NCAM 可能是通过增加 CB 的表达介导了 GDNF 对DA 神经元的保护作用。 本实验从正反两方面研究了 GDNF
22、对 DA 神经元的保护可以通过 NCAM这一 Ret 非依赖性通路发挥作用，为进一步探讨其作用机制提供了基础。参考文献 : 1 Nunes I，Tovmasian LT，Siwa RM，et al.Pitx3is required for devel-opment of substantia nigra dopaminergic neuronsJ.PNAS，2003，100（7）:4245-4250. 2 Lin LF，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF:a glial cell line-de-rived neurotrophic factor for midbrai
23、n dopaminergic neuronsJ.Sci-ence，1993，260（5111）:1130-1132. 3 Beck KD，Valverde J，Alexi T，et al.Mesencephalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotomy-induced degeneration in the adult brainJ.Nature，1995，373（6512）:339-341. 4 Tomac A，Lindqvist E，Lin LF，et al.Protection and repair of the ni-g
24、rostriatal dopaminergic system by GDNF in vivoJ.Nature，1995，373（6512）:335-339. 5 Trupp M，Scott R，Whittemore SR，et al.Ret-dependent and-inde-pendent mechanisms of glial cell line-derived neurotrophic factor sig-naling in neuronal cellsJ.J Biol Chem，1999，274（30）:20885-20894. 6 Paratcha G，Ledda F，Ibanez CF，et al.The neural cell adhesion mol-ecule NCAM is an alternative signaling receptor for GDNF family ligandJ.Cell，2003，113（7）:867-879.
